炎症在动脉粥样硬化过程中起着至关重要的作用。内皮是机体血管的重要保护屏障,血管内皮功能状态和结构完整性与动脉粥样硬化的发生、发展密切相关。血管内皮具有阻止巨噬细胞浸润和泡沫细胞形成及调节凝血、阻碍血栓形成的功能,从而防止动脉粥样硬化发生。血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A, SAA)不仅是一种急性反应蛋白的生物标志,可能还是心血管疾病的危险因素。SAA能够促进单核细胞趋化、黏附并且在动脉粥样硬化斑块处沉积。SAA能够增加高密度脂蛋白(HDL)对巨噬细胞和内皮细胞的亲和力,通过清道夫受体B-I (SRB-I)影响高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的吸收,促进细胞HDL-C的代谢。然而,SAA在内皮功能中的作用和机制还不太清楚。本研究拟分为三部分来探讨SAA对血管内皮细胞的影响机制及阿托伐他汀、硒的调节作用。第一部分急性冠脉综合征患者血清SAA、eNOS、HO-1和硒水平的比较目的SAA、eNOS、HO-1和硒对冠心病的保护性作用具有争议,本研究目的是观察急性冠脉综合征患者血清SAA、eNOS、HO-1和硒的水平,探讨发生ACS的发病机制和具有预测价值的炎性指标及可能的保护因素。方法选择90例ACS患者,其中急性心肌梗死42例(AMI组),不稳定性心绞痛48例(UAP组)以及同期的稳定型心绞痛41例(SAP组)和44例健康者(NC组),采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定所有入选者血清中SAA、eNOS、HO-1和硒水平。根据冠状动脉造影结果计算Gensini积分,根据Gensini积分分为<16分组、16～32分组和>32分组。结合病程(duration)、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、糖化血红蛋白Alc (HbAlc)等临床资料进行统计学分析。结果1.AMI组、UAP组、SAP组与NC组之间的年龄、性别无差异(P>0.05)SBP, DBP, TC, LDL-C和Gensini积分在AMI组、UAP组与SAP组、NC组比较均具有统计学差异(P<0.01)；Gensini积分在AMI组明显高于SAP组与NC组,比较具有统计学差异(P<0.01),在AMI组、UAP组、SAP组与NC组分别为31.77±16.63,23.51±10.39,24.24±10.06和0。2.AMI组患者SAA水平最高,UAP组次之,NC组SAA水平最低,两两比较有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；AMI组、UAP组eNOS、HO-1水平显著低于SAP组和NC组(P<0.01)；ACS组和SAP组的Se水平明显低于NC组(P<0.01),AMI组、UAP组、SAP组三组之间Se水平虽有所不同但未达到显著统计学差异(P>0.05)。SAA水平在AMI组、UAP组、SAP组和NC组分别为16.27±2.49,14.74±3.10,6.99±4.78,2.01±0.79；eNOS水平在AMI组、UAP组、SAP组和NC组分别为6.14±0.77,7.10±1.32,8.59±1.26,14.50±3.74；HO-1水平在AMI组、UAP组、SAP组和NC组分别为33.98±2.47,39.07±3.30,46.76±4.97,53.41±3.92；Se水平在AMI组、UAP组、SAP组和NC组分别为64.73±6.86,66.92±6.70,64.36±6.15,79.81±7.09。3.SAA水平随着Gensini积分的增加而上升,组间两两比较均有统计学意义(P<0.05)；eNOS、H0-1水平随着Gensini积分的增加而降低,<16分组与16～32分组比较无统计学差异,其它各组间两两比较均有统计学意义(P<0.05)；Se水平在0分组最高,<16分组、16～32分组、>32分组与0分组比较有统计学差异(P<0.01),其它各组间两两比较均无统计学意义。4.SAA与Gensini积分呈显著正相关r=0.706,与eNOS、HO-1、硒水平呈显著负相关,相关系数分别为r=-0.715、r=-0.828、r=-0.476；eNOS与Gensini积分呈显著负相关r=-0.675,与HO-1、硒水平呈显著正相关,相关系数分别为r=0.772、r=0.570；HO-1与Gensini积分呈显著负相关r=-0.651,与硒水平呈显著正相关,相关系数分别为r=0.520；硒水平与Gensini积分呈显著负相关r=-0.482。结论1.高血压、高血脂、高血糖是ACS发生的相关因素。2.ACS组SAA水平明显升高,eNOS、HO-1和硒水平降低,提示SAA、eNOS、HO-1和硒均参与了ACS的发生和发展。3.SAA水平随着Gensini积分的增加而上升,eNOS、HO-1及硒水平随着Gensini积分的增加而下降,提示SAA、eNOS、HO-1及硒水平可能与病变严重程度相关,SAA水平越高,eNOS、HO-1及硒水平越低,病变程度越严重。4.相关分析结果显示SAA与eNOS、HO-1和硒水平呈负相关,提示高水平的SAA可能通过降低eNOS、HO-1这些细胞、血管的保护因子而参与动脉粥样硬化的发生和发展。第二部分SAA对人脐静脉内皮细胞作用和机制的探讨目的探讨SAA对人脐静脉内皮细胞(human umbilical veinendothelial cells, HUVECs) eNOS、HO-1、SelS分子表达和一氧化氮(NO)、总抗氧化能力(T-AOC)和活性氧簇(ROS)的影响。方法HUVECs培养,待细胞融合至约70%左右时进行同步化处理后分组,分别在各组细胞培养液中加入不同浓度SAA(0mg/L,1mg/L,10mg/L,20mg/L),同时加入浓度为20mg/L的SAA分别作用于不同时间(0h,6h,12h,24h)后收获细胞,提取总RNA,通过实时荧光定量(RT-PCR)测定各组eNOSmRNA、HO-1mRNA和SelSmRNA转录水平；免疫印迹法(Western blotting)检测SAA对各组eNOS, HO-1, SelS蛋白表达的影响；同时用MTT测定各组细胞活性,检测细胞培养液中NO, T-AOC和ROS的含量并进行统计学分析。结果1.通过RT-PCR结果显示：SAA浓度为10mg/L,20mg/L作用于细胞24h后,可抑制eNOS mRNA, HO-1mRNA, SelS mRNA的转录且呈现出浓度依赖性,在SAA浓度10mg/L时灰度值分别为(2.43±0.71),(1.87±0.33),(1.65±0.48),在SAA浓度20mg/L时灰度值分别为(1.54±0.51),(1.61±0.40),(1.33±0.45)；终浓度20mg/L的SAA作用于细胞0h,6h,12h,24h,均可抑制;NOS mRNA, HO-1mRNA, SelS mRNA的转录且呈现出时间依赖性；20mg/L的SAA作用Oh,6h,12h,24h时,eNOS mRNA灰度值分别为(3.88±0.77),(2.97±0.24),(1.87±0.56),(1.54±0.51),HO-1mRNA灰度值分别为(2.48±0.44,),(2.20±0.46),(1.71±0.41),(1.61±0.40),Se1S灰度值分别为(2.86±0.73),(2.11±0.47),(1.63±0.39),(1.33±0.45)。2. Western blotting结果显示：浓度为l0mg/L,20mg/L的SAA作用于细胞24h后可抑制NOS, HO-1, SelS蛋白的表达且呈现出浓度依赖性,在SAA浓度1Omg/L时灰度值分别为(0.26±0.06),(0.34±0.09),(0.27±0.08),在SAA浓度20mg/L时分别为(0.21±0.05),(0.20±0.06),(0.06±0.01)；SAA在20mg/L条件下作用0h,6h,12h,24h后,可抑制‘NOS, HO-1, SelS蛋白的表达,且呈现出时间依赖性,eNOS蛋白表达灰度值分别为(0.49±0.12),(0.39±0.10)(0.21±0.05),(0.20±0.06),HO-1蛋白表达灰度值分别为(0.44±0.12)(0.42±0.11),(0.36±0.09),(0.20±0.06),SelS蛋白表达分别为(0.36±0.10)(0.28±0.08),(0.09±0.03),(0.06±0.01)。3.MTT结果显示10mg/L、20mg/L SAA作用12h、24h,可显著抑制内皮细胞活性,10mg/L时分别为0.53、0.47,20mg/L时分别为0.50、0.42。4.10mg/L、20mg/L的SAA作用24h均能明显减少内皮细胞中NO的含量,差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05),且SAA对NO含量的影响随着浓度的增大而增强(图20)。在10mg/L时NO含量为59.25±15.49μmol/L,20mg/L时NO含量为44.36±12.46μmol/L,与0mg/L组比较分别减少了21.7%和41.4%。5.10mg/L、20mg/L的SAA作用24h后,能够明显增加ROS水平,在10mg/L时为22.34±4.42,在20mg/L为28.544±4.97。6.10mg/L、20mg/L的SAA作用24h后,能够明显降低T-AOC,在10mg／L时为0.72±0.20,在20mg/L为0.58±0.18。结论1.高浓度的SAA能够明显抑制HOS、HO-1、SelS基因的转录和蛋白的表达且成浓度依赖性和时间依赖性,揭示了SAA浓度升高对细胞具有损伤作用,高浓度SAA作用时间越长对细胞的损伤越明显；2.高浓度的SAA能降低内皮细胞的活性和细胞的总抗氧化能力,减少NO的产量,增强氧化应激反应,使ROS的水平升高,从而导致内皮细胞功能受损,促使动脉粥样硬化的发生。第三部分阿托伐他汀、硒对SAA诱导下eNOS、HO-1、SelS的调节作用目的探讨阿托伐他汀、硒对SAA诱导下的HUVECs中eNOS、HO-1、SelS分子表达和对NO、T-AOC、ROS的影响及作用机制。方法把培养的HUVECs分为SAA组(加入SAA20mg/L), PDTC组(预先给予终浓度100μmol/L的NF-κB阻断剂PDTC处理1h后加入SAA20mg/L),硒组(给予硒100nmol/L加SAA20mg/L),阿托伐他汀组(阿托伐他汀10μmol/L加SAA20mg/L)、阿托伐他汀±硒组(阿托伐他汀10μmol/L加硒100nmol/L加SAA20mg/L),24h后通过实时荧光定量(RT-PCR)测定各组eNOSmRNA. HO-1mRNA和SelSmRNA转录水平,免疫印迹法(Western blotting)检测NOS、 HO-1、SelS蛋白的表达；同时对细胞增殖及细胞培养液中NO、T-AOC和ROS的含量进行测定和统计学分析。结果1.阿托伐他汀组和硒组显示出相似的结果,可以使eNOSmRNA、 HO-1mRNA、SelS mRNA和蛋白表达明显高于SAA组,结果具有统计学意义,阿托伐他汀组eNOS mRNA、HO-1mRNA、SelS mRNA分别为(2.57±0.05),(2.19±0.57),(2.22±0.58)；6NOS、HO-1、SelS的蛋白表达分别为(0.28±0.13),(0.29±0.07),(0.25±0.05)；硒组eNOS mRNA、HO-1mRNA、SelS mRNA分别为(2.13±0.40),(1.85±0.64),(2.01±0.55)；eNOS、HO-1、SelS的蛋白表达分别为(0.26±0.06),(0.33±0.08),(0.25±0.05)。2.阿托伐他汀加硒组eNOS、HO-1、SelS分子水平高于SAA组、阿托伐他汀组和硒组三组,与SAA组比较,结果具有统计学意义,eNOS mRNA、 HO-1mRNA、SelS mRNA分别为(4.13±0.25),(2.87±0.50),(2.63±0.37)；eNOS. HO-1、SelS的蛋白表达分别为(0.39±0.09),(0.36±0.06),(0.33±0.06)。3.预先给予PDTC能够阻断SAA对eNOS mRNA、 HO-1mRNA、 SelS mRNA和蛋白表达的抑制作用,与SAA组比较,结果具有统计学意义；4.给予四种干预措施后结果显示可以使细胞的活性增强,NO含量和T-AOC升高,ROS水平降低。NO含量在SAA组、Se组、Atv组、Se+Atv组、PDTC组分别(44.61±7.05)μmol/L,(52.58±7.16)μmol/L,(55.95±9.67)μmol/L,(70.94±10.92)μmol/L,(74.97±10.74)μmol/L,与SAA组比较分别增加了17.8%,25.4%,59.0%,68.1%；T-AOC分别为(0.58±0.18) mmol/ml,(1.74±0.49) mmol/ml,(1.87±0.42) mmol/ml,(1.96±0.51) mmol/ml,(2.37±0.65) mmol/ml; ROS水平分别为(22.82±4.68),(18.97±4.69),(16.75±4.86),(10.64±2.36),(9.67±2.47)。结论1.阿托伐他汀、硒均可改善高浓度SAA对eNOS mRNA、HO-1mRNA、 SelS mRNA和蛋白表达的抑制,能够提高细胞活性,使NO产量升高,增强细胞总抗氧化能力,降低ROS的含量,两者合用具有协同效应,提示阿托伐他汀、硒均能够减轻氧化应激,具有细胞保护作用,两者联合使用效果增强；2.NF-κB的阻断剂(PDTC)能够阻断高浓度SAA对eNOS、HO-1、SelS分子的抑制作用,增强细胞的活性,升高NO产量,使细胞T-AOC增强,ROS降低,提示SAA通过NF-κB途径实现对内皮细胞的调控。