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赤潮是一种严重的全球性海洋灾害,对公众健康、海洋环境、水产业和自然资源造成了严重负面影响。由于目前治理赤潮采取的物理和化学手段都存在着一些弊端,而生物防治方法因为有着安全、经济、高效等特点受到关注,特别是利用微生物方法治理赤潮受到学者们的广泛关注。
本论文探索了固体平板培养藻的方法;改良了藻培养液除菌技术,成功获得了三株无菌的藻培养体系:利用双层平板法从厦门海域分离到了一株能裂解三角褐指藻的溶藻微生物——PTV1,利用三角褐指藻的无菌培养体系纯化了PTV1,并对其进行了鉴定;探索了其溶藻方式、溶藻范围及保藏方法;考察了PTV1的溶藻抑藻效果;研究了PTV1的溶藻过程及条件;获得的主要结果如下:
1.利用双层平板培养实验室的25株藻种,其中有13株藻种可以在固体平板上生长,它们的藻细胞均较小(日本星杆藻除外),代表为单细胞绿藻:而其余12株藻种不能在固体平板上生长,它们的藻细胞均较大,代表为单细胞甲藻。固体平板培养藻使溶藻微生物的分离程序更为简便。
2.有效的改良了藻培养液除菌技术。通过对藻细胞重复洗涤、SDS和抗生素处理尝试除去藻培养液中的细菌。通过微生物培养和荧光显微镜观察对处理后的藻培养液进行无菌检验,结果均表明没有细菌的存在。这样我们成功的获得了三株无菌的藻培养体系,三角褐指藻的无菌培养体系(PT-d5)、自养小球藻的无菌培养体系(CA-d5)和球形棕囊藻的无菌培养体系(PG1-d5)。该法简单有效且耗时短,获得的三株无菌藻可以在实验室基本培养条件下保存,并进行下一步研究。
3.利用双层平板法从厦门海域分离到了一株能裂解三角褐指藻的特殊溶藻微生物——PTV1,这是有关三角褐指藻溶藻微生物的首次报道。利用三角褐指藻的无菌培养体系,通过双层平板法和终端梯度稀释法纯化了PTV1,并对其进行了初步鉴定:PTV1被1μm微孔滤膜截留;经过110g(1220rpm)、3000g(6380rpm)和19460g(13000rpm)离心5min后,活性均有所降低,分别是对照的39%、20%、10%;对氯仿敏感;用常规培养基和藻液培养基均不可培养,只有在活的藻体系中才可存活。
4.PTV1通过直接接触藻细胞杀藻,它对多种藻具有强烈的致死作用,通过不断向PTV1和藻的共培养体系中添加新鲜藻液便可持续保持PTV1的高效感染性,利用双层平板可保存PTV1两个月,而在4℃、20℃、-20℃、-70℃避光保藏的效果均较差。
5.溶藻过程中PTV1和藻细胞数量的动态变化:PTV1加入藻液后,藻浓度先升高,接着在一定浓度范围内波动,然后降低;刚开始PTV1含量下降,并维持在一个很低的水平,接着迅速升高,达到最高值后又迅速下降,然后又维持在一个很低的水平。
6.不同培养条件下PTV1对三角褐指藻的溶藻效果:无论光照与否PTV1对藻都有杀灭作用,说明PTV1裂解藻细胞时光照不是必要的;温度、盐度和pH对PTV1的溶藻效果影响不大,PTV1分别在20℃、盐度35‰、pH9.5时溶藻效果最好。
上述研究结果为分离筛选溶藻微生物提供了很好的方法,分离筛选到的溶藻微生物丰富了溶藻微生物的种类;将有助于人们更好的了解溶藻微生物和赤潮藻类相互作用的过程和机制;并为赤潮的微生物防治提供了可能的潜力巨大的资源与工具。