海藻是重要的生物资源,要实现海藻的综合性加工炼制,首先要对海藻生物质降解转化,主要依赖于来自微生物的各种多糖降解酶。寻求和探讨高效的褐藻降解微生物和降解酶,是生物质降解转化研究与应用的热点。本实验室从鲍鱼中筛选到一株具有高效褐藻胶降解能力的Agarivoransalbus B2Z047,本论文以该菌为研究对象,探究了对海带的降解能力及降解机制,取得了以下主要成果:一、完成了Agarivorans albus B2Z047的全基因组测序,利用NR、COG、GO、KEGG和CAZy数据库进行分析,发现318条编码CAZymes的基因,包括褐藻胶、纤维素、木聚糖、昆布多糖、淀粉、琼胶、几丁质和甘露聚糖等多糖的降解酶,仅A.albus B2Z047一种细菌可以完成对海带生物质的完全降解。对Agarivorans属中基因组进行比较分析,发现5株细菌编码CAZymes的基因占比为5.03%-7.29%不等,表明该属菌具有广泛的多糖降解能力。二、利用Agarivorans albus B2Z047进行了海带降解试验,表明单一菌株可以对海带彻底降解,能降解灭菌的“熟”海带和鲜海带。在50mL人工海水中,接种量为10%培养基的种子液菌体,降解总量0.5 g、大小为1×1 cm的海带叶片时,降解效率最高,22 h可完成降解,降解率为50.8%。在降解过程中海带出现挤压、疏松、内陷、结构破坏等过程,最后变成细微颗粒物。海带中甘露醇被快速消耗利用,分泌褐藻胶裂解酶、昆布多糖酶、淀粉酶和纤维素酶,在多种酶的共同作用下完成了海带的降解过程。三、完成了 Agarivorans albus B2Z047降解海带0h,8h和24h的转录组测序分析,比较了三个时间点的基因表达量变化。筛选到14个主要的差异上调表达基因,通过RT-qPCR实验分析,发现14条基因在8 h时上调表达,最高上调9.7倍,最低4.5倍,主要是编码褐藻胶、纤维素、淀粉和昆布多糖降解相关的CAZymes基因,表明8h是海带降解的关键时期。降解24h时,14条基因表达量不再增加。四、对两条PL17家族的褐藻寡糖裂解酶进行了异源表达,对结构和酶学性质进行了分析。Alg9和Alg10无信号肽,预测是胞内褐藻寡糖裂解酶。二者都是双结构域,由α螺旋为主的PL17结构域和β-折叠结构为主的肝素酶Ⅱ/Ⅲ结构域组成,以同源二聚体的形式发挥褐藻胶降解作用。对PL17结构域和全酶序列分别进行了异源重组,只有全酶序列获得活性表达,表明肝素酶结构域对维持酶活性是必须的。Alg9的最适反应温度为50℃,pH为7.0,酶活性受到Mn2+、Zn2+、Fe2+和SDS的促进。Alg10的最适反应温度为 25℃,pH 为 7.0,酶活性受到 Cu2+、Zn2+、Ni2+、Ba2+、Fe3+、SDS 和 EDTA 的抑制。两者都是外切型双功能酶,降解长链分子产生单体,对PolyM有明显偏好性。