论文部分内容阅读
番茄黄化卷叶病毒病和番茄根结线虫病是番茄中发病率高、传播广的两种病害。本研究中,采用番茄黄化卷叶病毒病的抗病纯合材料(Ty-1/Ty-1、Ty-3a/Ty-3a)、抗病杂合材料(Ty-1/ty-1、Ty-3a/ty-3a)和感病纯合材料(ty-1/ty-1、ty-3a/ty-3a)以及番茄根结线虫病抗病纯合材料(Mi/Mi)、抗病杂合材料(Mi/mi)和感病纯合材料(mi/mi)作为实验材料,参考已发表的相关文献设计特异性引物,首先获得了Ty-1、Ty-3a和Mi这三个抗病基因各自的分子标记,然后以这三个分子标记为基础,建立了能够同时鉴定Ty-1和Ty-3a、Ty-1和Mi的两个双重PCR体系。Ty-1基因的分子标记:先利用特异引物TY-1F/TY-1R对实验材料进行PCR扩增后,所有的材料均扩增出了长度为398 bp的特异片段。经过酶切反应,感病基因型的实验材料只有一条398 bp的特异片段;而纯合抗病基因型的实验材料则为303 bp和95 bp两条片段;杂合抗病基因型的实验材料则呈现出398 bp、303 bp和95 bp三条片段。引物序列为TY-1 F:5’-TAA TCC GTC GTT ACC TCT CCT T-3’;TY-1 R:5’-CGG ATG ACT TCA ATA GCA ATG A-3’。Ty-3a基因的分子标记:先利用特异引物TY-3a F/TY-3a R对实验材料进行PCR扩增,所有的实验材料均扩增出相同的长度为689 bp的特异条带。经Taq I酶切后,纯合抗病材料出现350 bp和150 bp的特异条带,感病材料出现500 bp的特异条带,杂合抗病材料为500 bp、350 bp和150 bp三条条带。本实验所使用的特异引物的序列为TY-3a F:5’-GCA AAC AAG TTC CCC CAC TA-3’;TY-3a R:5’-CGC AGA ACC AGC TAC TTT CC-3’。Mi基因的分子标记:先利用特异引物MIF/MIR对实验材料进行PCR扩增,所有的材料均扩增出长度为750bp的特异片段。用Taq I酶进行酶切后,感病基因型的材料仍为750 bp的特异性条带;而纯合抗病基因型的材料经酶切后出现长度570bp和180 bp的两条特异性条带;杂合抗病基因型的材料酶切后获得750 bp、570 bp和180 bp三条特异性条带。引物序列为MI F:5’-TCG GAG CCT TGG TCT GAA TT-3’;MI R:5’-GCC AGA GAT GAT TCG TGA GA-3’。以上述单个基因分子标记作为基础,将引物TY-1、引物TY-3a同时加入到一个PCR体系,引物TY-1、引物MI同时加入到一个PCR体系,反复对底物浓度、引物比例、退火温度等实验条件进行优化,最终建立了同时检测抗病基因Ty-1、Ty-3a的双重PCR体系和同时检测Ty-1、Mi的双重PCR体系。利用所获得的双重PCR反应对未知基因型的育种材料进行鉴定,获得同时含有Ty-1、Ty-3a基因的纯合抗病基因型的材料3株;同时含有Ty-1、Mi基因的纯合抗病基因型材料7株。本实验所得双重PCR技术不仅为抗病基因聚合育种提供一种有效的方法,筛选获得的新种质也为进一步培育具有复合抗病性的番茄新品种奠定基础,对提高番茄品种的抗病性和番茄生产的持续稳定发展具有重大意义。