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一、注射用益气复脉(冻干)与临床常用9种药物联合使用的安全性研究目的:通过小鼠耳廓蓝染类过敏实验、家兔滴注体温升高实验及溶血与凝血实验,对注射用益气复脉(冻干)(Yiqi Fumai Lyophilized Injection,YQFM)与9种临床常用药物联合使用的类过敏反应、发热反应、溶血或凝聚反应进行研究。方法:(1)小鼠耳廓蓝染类过敏实验,尾静脉注射含有0.4%伊文思蓝(Evans blue,EB)的受试物生理盐水溶液。阳性对照组给予含有Compound 48/80-0.4%EB的生理盐水溶液;阴性对照组给予含有0.4%EB的生理盐水溶液;单独药物组给予“单独药物组-0.4%EB的生理盐水溶液”;混合药物组给予用“单独药物组-0.4%EB的生理盐水溶液”配制的YQFM。按照小鼠耳廓蓝染试验标准,对小鼠耳廓蓝染面积进行评估,并测定小鼠耳廓EB渗出量。(2)小鼠血液组胺检测实验,除将耳廓蓝染类过敏实验中全部0.4%EB生理盐水溶液换做生理盐水外,给药方法与之前相同。给药30 min后取血,用化学荧光方法测定小鼠血液组胺释放率。(3)家兔滴注体温升高实验,分为单独和混合给药组,耳缘静脉滴注受试物生理盐水溶液。测量家兔体温,按照发热反应判断标准对家兔体温变化进行评价。(4)溶血或凝聚实验,将阳性与阴性对照组、单独和混合给药组药液分别加入到2%红细胞混悬液中。37 ~oC孵育3 h后,对溶血或凝聚反应进行观察。试管离心,在545 nm处测量上清液中血红素的吸光度,计算得到溶血率。结果:(1)维生素B6、盐酸纳洛酮注射液的单独与混合给药组,小鼠耳廓蓝染类过敏实验结果为阳性。(2)小鼠血液组胺含量,单独给药组与混合给药组之间无显著差异。(3)家兔滴注发热反应,仅氨茶碱注射液给药后家兔出现发热反应。(4)试管法溶血或凝聚实验中,单独与混合给药组实验结果均符合规定。(5)分光光度法与试管法实验结果存在一定差异,单独给药组中奥扎格雷和注射用环磷酰胺在全部给药剂量下,溶血率均小于5%;在混合给药组中,除氨茶碱、维生素B6和奥扎格雷注射液外,其他受试物的溶血率均小于5%。结论:(1)小鼠耳廓蓝染类过敏实验,混合给药组较单独给药组并无新增类过敏阳性结果出现。(2)家兔滴注发热反应实验,混合给药组较单独给药组体温变化无显著差异,发热反应与混合给药无关。(3)试管法与分光光度法对溶血或凝聚实验结果不一致。分光光度法可以量化溶血程度,结果可能更加准确。两种方法所得结果中,混合给药组较单独给药组均无新增溶血或凝聚反应的现象。二、仿生硅化固定嗜热菌蛋白酶用于制备低分子量鱼精蛋白的研究目的:仿生硅化方法固定嗜热菌蛋白酶(thermolysin,TLN),使用固定TLN酶解鱼精蛋白,分离纯化酶解产物,得到目标产物低分子量的鱼精蛋白(low molecular weight protamine,LMWP)。方法:(1)仿生硅烷固定TLN,四甲氧基硅烷(tetramethyl orthosilicate,TMOS)为仿生硅化前驱体;多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine,PLL)为生物模板。酸化后的TMOS加入到PLL和TLN的混合溶液中,反应5 min既得。(2)分离纯化LMWP,将固定TLN加入鱼精蛋白溶液中,使用快速蛋白液相色谱(Fast protein liquid chromatography,FPLC)对酶解产物分离纯化,得到LMWP。(3)优化LMWP分离纯化方法,在55%流动相B梯度前,加入低浓度梯度洗脱,以分离得到单个LMWP色谱峰。(2)优化TLN仿生硅化固定方法:使用DOE实验设计,对TLN、TMOS、PLL及酶解时间对固定TLN酶活性的影响进行研究,Minitab系统对结果进行分析,优化得到固定TLN方法。结果:(1)分离纯化LMWP洗脱过程:A:Tris-盐酸缓冲盐;B:Tris-盐酸和氯化钠缓冲盐为流动相。在前期洗脱程序的基础上增加洗脱梯度,洗脱条件确定为流动相B:0-20 min:33%;20-50 min:40%;50-70 min:55%;70-80 min:100%,分离得到单个LMWP色谱峰(2)选择TMOS浓度7.5%,PLL投入量0.3 mg,TLN加入量0.3 mg,酶解时间3.5 h为仿生硅烷方法固定TLN的实验条件。结论:本研究首次使用仿生硅化方法固定TLN。通过优化FPLC洗脱条件,分离得到单个LMWP色谱峰。使用DOE实验设计,Minitab软件对实验结果进行分析,优化得到仿生硅化固定TLN的条件。