研究目的：前列腺癌(Prostate cancer, PCa)是男性泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤,严重威胁着男性健康。我国是前列腺癌发病率和死亡率均较低的国家之一。但近年来,随着我国人民生活水平的提高、饮食结构的改变及医疗诊断水平的提高,其发病率呈现快速增长趋势。早期局限性PCa可以通过手术治疗和放疗完全治愈。对于非局限性、不能手术的PCa患者,根据PCa生长依赖于雄激素和雄激素受体(Androgen receptor,AR)信号通路的特性,通常采用雄激素去势联合应用雄激素受体拮抗剂的雄激素阻断疗法(Androgen deprivation therapy, ADT)进行治疗。起初,ADT对大多数患者有效,但是经过一段时间的治疗后,患者会复发并进展为致命的去势抵抗性前列腺癌(Castration resisitant PCa, CRPC)。CRPC对抗雄激素药物治疗耐受,这种现象在临床上称为“抗雄激素抵抗”。CRPC目前尚无有效的治疗方法,其发生进展机制也尚未阐明,但目前普遍认为其与AR信号通路的重新激活密切相关,因此,AR是治疗前列腺癌的关键靶标。本研究论文以前列腺癌发生发展过程起关键作用的分子AR为靶点,基于AR配体结构域(Ligand Binding Domain, LBD)的晶体结构以及现有AR拮抗剂与ARLBD的作用模式,综合运用药物化学、化学生物学和计算机化学等药物设计和发现策略,设计合成结构全新的AR拮抗剂做为抗前列腺癌候选药物。研究方法：首先,我们根据Me-too药物的设计原则,对用于CRPC治疗的第二代AR拮抗剂恩杂鲁胺进行微小的结构改造,设计合成一系列乙内酰硫脲类衍生物。该类化合物的合成以2-取代对硝基苯甲酸和取代苯胺为原料,通过缩合反应、还原反应、strecker反应、及硫代乙内酰脲成环反应制备。该系列化合物的生物活性评价通过实时荧光定量PCR法、荧光素酶报告基因法和MTT法分别对其前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen, PSA)表达抑制活性、AR转录抑制活性和抗增殖活性进行测定。由于目前临床上应用的的AR拮抗剂都包含相同的结构片段,我们推测这可能与耐药性的产生有关。为了寻找具有全新结构骨架的小分子AR拮抗剂,我们用计算机辅助药物设计软件SYBLE X1.1中的药效团构建模块GALAHAD以五个AR拮抗剂为模板构建3D药效团,并用UNITY模块产生药效团模型3D提问式对商业化合物数据库搜索,寻找符合药效团模型特征的化合物,用Surflex dock模块将得到的化合物与野生型AR和突变型AR对接,将与两个受体对接打分值都大于7的化合物进行结合模式分析,挑选出结合模式较好且能够从商业途径获得的化合物。然后通过荧光偏振法、实时荧光定量PCR法和MTT法对虚拟筛选得到的化合物的AR亲和力、PSA抑制活性和前列腺癌细胞生长抑制活性进行评价。虚拟筛选过程中发现的化合物T3的PSA抑制活性较低,为了提高T3的AR转录抑制活性和抗增殖活性,我们对化合物T3进行了结构改造,通过对中间连接链和两端芳环不同取代基的考察,设计合成一系列吡唑衍生物进行构效关系研究。该类化合物的合成以取代苯乙酮为原料,经克莱森缩合反应、吡唑成环反应、N-烷基化反应、水解反应、傅-克反应及缩合反应制备。通过实时荧光定量PCR法和MTT法对该类化合物的PSA表达抑制活性和抗增殖活性进行测定。本论文合成的化合物结构通过核磁共振氢谱(1H-Nuclear Magnetic Resonance, 1H-NMR)、核磁共振碳谱(13C-Nuclear Magnetic Resonance,13C-NMR)和高分辨质谱(High Resolution Mass Spectra, HRMS)等方法进行确证,并用高效液相色谱法(Hign Performance Liquid Chromatography, HPLC)进行了纯度测定,RY-1型显微熔点测定仪测定了目标化合物的熔点。经查阅文献证实,除个别化合物外所合成的目标化合物均为新化合物,未见文献报道。研究结果：通过研究乙内酰硫脲类衍生物对野生型和T877A突变型AR的拮抗激动活性和抗增殖活性,发现大部分的化合物与恩杂鲁胺一样,能够选择性抑制表达AR的LNCaP细胞的增殖,而对雄激素非依赖的PC-3细胞无作用。其中7t是活性最好的化合物,其对前列腺癌细胞LNCaP的生长抑制活性(Gl50=1.78μM)较恩杂鲁胺(GI50＝23.58μM)提高了15倍。化合物7t表现出与恩杂鲁胺相似的选择性抑制LNCaP细胞生长的特点,然而其对AR的转录抑制活性较恩杂鲁胺有所下降,对去势条件下LNCaP细胞生长抑制活性较恩杂鲁胺高,说明化合物7t的作用机制可能与恩杂鲁胺不同。化合物7i和7j对AR转录抑制活性和LNCaP细胞生长抑制活性较恩杂鲁胺更高,它们同时对不表达AR的前列腺癌细胞PC-3也有很强的的抑制活性,说明化合物7i和7j可能通过AR依赖和AR非依赖双重途径发挥作用。化合物7j和7t可能在CRPC的治疗中较恩杂鲁胺有优势,其作用机制和成药性值得进一步研究。虚拟筛选过程中构建的药效团模型含有三个疏水性中心和三个氢键受体六个特征元素,与之前文献报道的药效团特征部分相符。通过对虚拟筛选得到的9个具有不同结构骨架的小分子的活性测试发现,9个小分子化合物均能与二氢睾酮(Dihydrotestosterone, DHT)竞争性结合AR、抑制AR的转录活性,证明了我们基于药效团和分子对接的虚拟筛选方案的可行性。化合物T3、T4、T6和T8与MDV3100相似,均能够选择性抑制雄激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP的生长,而对雄激素非依赖的前列腺癌细胞PC-3无明显影响。其中,化合物T3能够与DHT竞争性结合AR,显著抑制AR的转录活性,并且对雄激素依赖的前列腺癌细胞LNCaP的生长抑制活性(GI50=16.52μM)优于MDV3100。化合物T3可以作为研究AR拮抗剂的先导化合物,进行进一步结构修饰。通过对先导化合物T3的结构修饰,我们设计合成了吡唑-5-酮类衍生物和吡唑-5-甲酰胺类衍生物。我们对吡唑-5-甲酰胺类衍生物两端苯环和吡唑1位N上的取代基进行了考察,得到一系列吡唑-5-甲酰胺类衍生物。通过测试该类化合物对AR的转录抑制活性,总结吡唑-5-甲酰胺类衍生物的构效关系为：1)R1位上的取代基CF3,F>C1、Br和CH3；2)R2位上甲基或乙基取代对PSA的抑制活性无明显影响；3)R4位单取代优于R3或R5,R4位上单取代溴、氯、三氟甲基、氰基和硝基优于乙炔基、氟和氢；当R4位为三氟甲基时,在R5位引入卤素能够提高化合物对PSA的抑制活性。该类化合物中活性最好的两个化合物是H25和H43,与先导化合物T3相比：1)对PSA的抑制活性有所提高：H25和H43在10μM浓度下对PSA的抑制活性分别为100.00%和87.90%,而先导化合物T3和阳性对照药恩杂鲁胺分别为60.71%和96.79%；2)对LNCaP细胞的生长抑制活性提高了3-4倍：H25和H43的GIso分别为7.73和3.54μM,而先导化合物T3和比卡鲁胺的G150分别为16.52和23.11μM;3)能够抑制雄激素非依赖性前列腺癌细胞PC-3的生长。以上结果提示这些化合物可能通过AR依赖性和AR非依赖性双重途径发挥作用,具体作用机制有待进一步阐明。结论及意义：本研究论文以AR为靶点,基于ARLBD的晶体结构以及现有AR拮抗剂与ARLBD的相互作用模式,以恩杂鲁胺为先导设计合成了一系列乙内酰硫脲衍生物；同时运用基于药效团和分子对接的虚拟筛选策略发现了骨架结构全新的先导化合物T3,并对T3进行结构修饰设计合成了吡唑-5-酮类衍生物和吡唑-5-甲酰胺类衍生物,总结了吡唑-5-甲酰胺类衍生物的构效关系。通过初步的体外活性测试,我们发现乙内酰脲类衍生物7j和7t可能在CRPC的治疗中较恩杂鲁胺有优势,其作用机制和成药性有待进一步研究。以上结果为我们设计合成新的AR拮抗剂提供了依据。