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研究背景和目的:诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)是指将体细胞进行重编程转化为具有胚胎干细胞特性和功能的多能干细胞。2006年,日本研究者Takahashi和Yamanaka等筛选了24种在小鼠早期胚胎和胚胎干细胞中表达丰富的转录因子,最终通过逆转录病毒载体将其中4种因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc(OSKM,又称Yamanaka因子)转入胚胎小鼠或成年小鼠的成纤维细胞中,并成功地将其诱导成为具有与胚胎干细胞类似多能性的新细胞,命名为诱导多能干细胞。与胚胎干细胞类似,诱导多能干细胞可用于再生医学,可用于制作疾病模型进而研究疾病发生机制,也可用于辅助新药的筛选,具有广泛的应用前景;与此同时诱导多能干细胞避开了胚胎干细胞的伦理问题,为此获得了更加广泛的关注。Yamanaka也凭借该研究获得了2012年医学或生理学诺贝尔奖。然而,i PSCs的诱导效率低下;由i PSCs分化而成的小鼠有很高的肿瘤发生率,研究者多认为这与Yamanaka因子中原癌基因的转染与激活有关:这些问题给i PSCs的广泛临床应用带来了障碍。研究者不断研究重编程过程的机制,并提出新的方法来改进i PSCs的诱导策略,以提高重编程效率,并减少转录因子的使用种类而提升i PSCs的安全性。在这些方法中,一部分小分子化合物的应用取得了好的效果。这些小分子包括调节遗传物质修饰的化合物,例如DNA甲基转移酶抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和组蛋白甲基转移酶G9a抑制剂;也包括作用于细胞信号通路传导的化合物,例如MEK抑制剂和GSK3抑制剂。丙戊酸(valproic acid,VPA),是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂,作为一种传统的抗癫痫药物,被证实能够显著提高i PSCs的诱导效率(超过100倍)。而这一结果的发生机制尚未阐明。目前已有的研究表明,重编程过程中衰老核心通路p53/p21通路和p16通路被激活,而抑制这两条通路能够显著提升重编程效率,提示细胞的衰老成为阻碍重编程的重要瓶颈,故本研究拟探讨VPA是否通过抑制重编程过程中的衰老来促进重编程。主要方法:本研究分为3大部分,首先为诱导小鼠成纤维细胞MBW-2细胞系重编程,比较有无VPA情况下衰老相关指标的区别,判断VPA对重编程过程中细胞衰老的作用;接着利用Cu SO4处理小鼠MBW-2细胞及小鼠原代细胞制作体外衰老模型,判断VPA对衰老的作用;最后探究VPA对衰老作用的机制。1.诱导小鼠成纤维细胞MBW-2细胞系重编程,并对添加/未添加VPA的组分别进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)染色和衰老相关的β半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SAβ-gal)染色;2.采用Matos等提出的方法,使用不同浓度的硫酸铜(Cu SO4)处理小鼠成纤维细胞(MBW-2细胞系和小鼠组织来源的原代成纤维细胞),通过MTT选择合适浓度制作体外衰老模型;3.选择合适浓度的Cu SO4制作衰老模型,同时设置空白对照组、Cu SO4组、VPA组和Cu SO4+VPA组,进行形态观察、SAβ-gal染色、磺基罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)检测判断VPA对衰老的影响;4.分别对处理结束的细胞进行PCR、western blot来检测衰老相关基因(包括caveolin-1、p16、p21、HMOX-1、Apo J)的分子水平表达;5.同时检测处理结束后的细胞周期。结果:1.在重编程实验中,VPA处理组AP染色阳性的细胞集落数量增多,表明VPA能够促进MBW-2细胞重编程。VPA处理组SAβ-gal染色阳性细胞比例较无VPA处理组降低,表明VPA在促进成纤维细胞重编程的同时能够抑制重编程过程中的细胞衰老。2.低浓度Cu SO4对小鼠成纤维细胞生长影响不明显,而高浓度Cu SO4造成细胞大量死亡;适当浓度Cu SO4可以使细胞出现应激导致的早老性衰老(stress induced premature senescence,SIPS)的表现,包括细胞变大、变扁平,增殖减缓,SAβ-gal染色阳性细胞比例增高等;3.在Cu SO4致衰老体外模型中,Cu SO4组细胞体积增大、细胞扁平,而Cu SO4+VPA组的形态与空白对照组相似,VPA组本身与空白对照组无明显区别;Cu SO4+VPA组SAβ-gal染色阳性细胞比例较Cu SO4组降低,而VPA组与空白对照组无明显区别;4.Cu SO4组衰老相关基因表达上调,而Cu SO4+VPA组上调不明显;在蛋白水平上,Cu SO4组p16和p21表达增加,而Cu SO4+VPA组表达增加不明显;5.Cu SO4组细胞发生了明显的G2/M期阻滞,而Cu SO4+VPA组细胞G2/M期阻滞不似前者明显。结论:1.VPA能够显著提升MBW-2细胞重编程为i PSCs的效率;2.在体外Cu SO4衰老模型中VPA具有抗衰老的作用;3.VPA抗衰老的作用机制在于解除细胞周期阻滞,下调衰老通路p16、p21通路;4.VPA可以通过下调p16、p21通路及解除细胞周期阻滞来抑制重编程过程中的衰老,进而提升重编程效率。创新点:本研究证明VPA可以通过下调衰老通路p16、p21通路以及解除细胞周期阻滞来抑制重编程过程导致的细胞衰老进而提升重编程效率。