传统的肿瘤治疗方法主要有三种：手术、放疗和化疗,但这三种方法均存在一定的局限性,这促使人们去寻找更加理想的治疗方法。近些年来,随着人们对肿瘤发生机制的深入了解,以及肿瘤免疫学、分子生物学及生物工程技术的发展,肿瘤生物治疗(Biotherapy/Immunotherapy)迅速发展起来,成为肿瘤综合治疗中的一种新的治疗模式。肿瘤生物治疗可概括为：任何生物学物质或生物制剂在肿瘤的治疗性应用；它主要通过调动机体的天然防卫机制或给予天然(或基因工程)产生的靶向性很强的物质来取得抗肿瘤效应。目前已经开展的肿瘤生物治疗技术和方法主要包括：肿瘤疫苗、细胞因子、基因治疗、单克隆抗体、生物反应调节剂的应用以及过继性免疫治疗等；其中使用机体免疫细胞对抗肿瘤的过继性免疫治疗发展较为成熟,在肿瘤生物治疗中占有重要地位。树突状细胞(dendritic cells, DCs)作为目前已知的最强的抗原呈递细胞(Antigen presenting cells, APCs),处于维持和调节机体免疫应答的中心环节。越来越多的证据表明由DC激活的免疫应答,在机体抵御恶性肿瘤中发挥着十分重要的作用；以DC为基础的细胞免疫治疗(也称为DC疫苗),已成为肿瘤生物治疗领域备受关注的热点之一。目前已经开展了多项以DC疫苗为主要肿瘤治疗手段的临床实验；第一种被FDA批准用于临床的治疗性疫苗,Provenge (sipuleucel-T),已与2010年上市,并用于晚期前列腺癌患者的治疗。机体的抗肿瘤免疫应答由成熟DC与微环境中的其他免疫细胞所主导,其中初始T细胞(naive T cells)的分化方向对抗肿瘤免疫应答起到重要的调节作用。初始T细胞在DC的作用下发生极化,主要分化为两类不同的辅助性T细胞(Thelper cells, Th cells), Thl细胞和Th2细胞。Thl细胞分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子,介导细胞免疫和炎症反应等；Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13,介导体液免疫应答和超敏反应。选择性激活Th1或Th2细胞是调节免疫应答的关键环节,对机体的抗肿瘤免疫具有重要影响；DC与微环境中的其他因子决定了初始CD4+T细胞向Th1细胞或Th2细胞分化。尽管在实验室制备的DC疫苗在临床前实验特别是体外实验中取得了较好的效果,但是在临床应用中却存在诸多问题,主要包括诱发的抗肿瘤免疫应答较弱、个体差异大等。DC疫苗在体外和体内特别是临床治疗应用中抗肿瘤治疗效果的显著差异提示,体内的肿瘤微环境可能会影响甚至改变DC的性质和功能。肿瘤微环境的主要特征包括乏氧,低pH值和营养缺乏等。局部乏氧是实体瘤肿瘤微环境的重要特征,不仅对肿瘤细胞本身的生物学行为有重要影响,如对放化疗抵抗、转移能力增强等；而且会显著影响肿瘤局部免疫细胞的性质、功能和基因稳定性等。在乏氧微环境下,肿瘤细胞的基因不稳定性增高,容易发生DNA双链断裂(double-strand breaks, DSBs)等DNA损伤。DNA DSBs主要有两种修复方式,同源重组(homologous recombination, HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)。在乏氧条件下,HR和NHEJ这两中主要的DNA DSBs修复通路都会受到显著抑制,需要其他的通路参与DSBs的修复。微同源序列介导的末端连接(microhomology-mediated end joining, MHEJ)是一种新近发现的DSBs修复方式；在乏氧环境下,由于主要DSBs修复通路受到抑制,其作为一种“后备”修复通路,活性可能会得到增强。人单核来源的DC,在其分化和成熟过程中,伴随着广泛的基因表达变化,其中可能存在着DNA的断裂和修复。研究发现,MHEJ不仅与肿瘤的发生和进展有关,而且在免疫系统发育和B细胞分化中具有独特而又重要的作用；但是MHEJ是否在DC特别是乏氧微环境下的DC分化和成熟过程中作为一种重要的参与机制,还未见相关报道,需要进一步的研究。本课题研究了乏氧微环境下DC对Th细胞极化的影响,探讨了其可能的机制,为改进和提高DC疫苗治疗肿瘤的临床效果提供了理论基础；并且建立了MHEJ这一DNA DSBs修复方式的细胞基础的报告系统,可用于研究MHEJ对乏氧DC功能的影响及其可能的参与机制。第一部分乏氧DC诱导初始T细胞发生非典型的Th2极化目的：在乏氧微环境下诱导人单核细胞来源的DC,研究其对初始T细胞极化特别是细胞因子表达谱的影响。方法：采用密度梯度离心法从健康人外周血中分离单个核细胞,然后用CD14磁珠阳性分选分离纯化单核细胞；单核细胞分别在常氧(21%O2、5%CO2)和乏氧(1％O2、5%CO2和94%N2混合气体)条件下在含GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(500U/ml)的RPMI1640培养基中诱导分化,在第5天未成熟DC (immature DC, imDC)培养基中加入1ug/ml LPS,刺激DC成熟,在第7天收取成熟DC (mature DC, mDC)。密度梯度离心法分离健康志愿者外周血单个核细胞,然后用Naive CD4+T Cell Isolation Kit II阴性分选分离纯化Naive CD4+T细胞。将分选的Naive CD4+T细胞与在不同培养条件下(常氧、乏氧)诱导的成熟DC共培养,在第5天加入IL-2(50U/ml),继续培养至第9天时加入PMA (100nM)和离子霉素(1μg/ml);24小时后收集上清,用悬浮芯片技术检测Th2细胞因子的表达；同时用CD4磁珠分离共培养体系中的CD4+T细胞,提取RNA,逆转录为cDNA后,用实时定量PCR检测Th2极化相关调控因子mRNA的表达。结果：在乏氧微环境下培养诱导的成熟DC与初始T细胞共培养后,通过悬浮芯片检测发现,IL-4这一Th2应答的标志性细胞因子的表达明显升高(约为常氧对照组的2倍)；这说明乏氧DC诱导初始T细胞发生Th2优势应答,与我们以前的研究中得到的结果相一致。但是另外两个主要的Th2细胞因子,IL-5和IL-13,其表达却显著下降；分别下降了7倍和5倍,高于IL-4的升高倍数。同时,我们发现调控Th2细胞因子表达的转录基因GATA3和c-Maf的表达,与常氧对照组相比较,也发生了显著变化。调控IL-4表达的c-Maf mRNA的表达显著上调(>25倍),而调控IL-5和IL-13表达的GATA3mRNA的表达则仅略微下调(下降了27%)。结论：乏氧条件下培养的DC使得初始T细胞发生非典型的Th2极化,IL-4的表达升高,而IL-5和IL-13的表达则降低；这些改变可能与调控Th2细胞因子的转录因子表达改变有关。第二部分KIF2A/MT1-MMP/CD44参与乏氧DC诱导的非典型Th2极化目的：研究乏氧DC诱导的非典型Th2极化的可能参与分子与调控机制。方法：1.采用基因芯片技术检测并比较常氧和乏氧条件下DC的基因表达谱,寻找感兴趣的可能与DC引发非典型Th2应答相关的分子；并用实时定量PCR验证基因芯片的结果：2.根据芯片结果,选取CD44这一分子作为研究对象。采用流式细胞术、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)进一步检测CD44在DC表面和上清中的表达；3.在未成熟DC培养基中加入CD44结合性抗体(J173mAb),同时加入LPS刺激DC成熟；48小时后,收集成熟DC与初始T细胞共培养,按第一部分所述方法进行Th细胞极化试验。收集上清,采用悬浮芯片技术检测Th2细胞因子的表达；同时分离CD4+T细胞,提取RNA,用实时定量PCR检测GATA3和c-Maf的表达；4.根据基因芯片检测的结果,调取参与调控CD44表达的基因膜型基质金属蛋白酶-1(membrane type1metalloprotease, MT1-MMP)的表达,用实时定量PCR验证其mRNA水平的表达,并采用免疫荧光和western blot分别定位和检测MT1-MMP蛋白水平的表达；5.在DC培养基中加入MT1-MMP阻断抗体,分别采用流式细胞术和ELISA检测MT1-MMP对CD44在DC表面和上清中表达的影响；6.在基因芯片结果中,调取与MT1-MMP表达调控可能相关的驱动蛋白超家族(kinesin superfamily protein, KIF)基因的表达情况；用实时定量PCR和western blot分别进一步确认相关基因的表达改变；7.用特异性siRNA敲减KIF2A这一KIF家族差异表达基因在DC的表达,并用实时定量PCR、western blot以及免疫荧光技术检测其对MT1-MMP表达的影响；用免疫共沉淀法检测KIF2A与MT1-MMP蛋白之间的相互作用；同时采用流式细胞术检测KIF2A siRNA是否能直接影响CD44在DC的表达；8.采用特异性siRNA敲减的方法,探讨KIF2A在乏氧DC的表达是否受缺氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)的调控。结果：1.基因芯片结果表明,与常氧成熟DC相比较,CD44在乏氧成熟DC的表达显著增高；实时定量PCR进一步验证了这一结果；2.流式细胞术检测发现,乏氧成熟DC表面的CD44表达上调；而ELISA结果表明,DC上清中可溶性CD44的表达降低；3.加入CD44结合性抗体后,乏氧DC能进一步促进初始T细胞向非典型Th2极化方向分化,表现为进一步的IL-4分泌水平升高和IL-5和IL-13的表达降低；4.比较常氧和乏氧DC的基因芯片检测结果发现,乏氧成熟DC MT1-MMP的表达下调；实时定量PCR和、vestern blot进一步证实了MT1-MMP在mRNA和蛋白水平的下调表达；免疫荧光检测显示MT1-MMP主要定位于DC的胞浆,并且在乏氧DC的表达弱于常氧DC；5.加入MT1-MMP阻断性抗体后,DC表面的CD44表达升高,而上清中可溶性CD44的表达下降；6.从基因芯片结果中调取KIF家族主要成员在DC的表达情况,发现乏氧能下调KIF2A在成熟DC的表达；这一结果通过实时定量PCR和western blot得到了进一步证实；7. KIF2A siRNA能敲减KIF2A在DC的表达(mRNA和蛋白水平),同时其能使MT1-MMP在DC的表达显著下调；通过免疫共沉淀实验发现,KIF2A和MT1-MMP蛋白之间存在相互作用；KIF2A siRNA也能直接上调CD44在DC的表达；8.乏氧条件下培养的DC,在LPS刺激成熟过程中,HIF-1α的表达显著增高；在乏氧条件下,采用特异性siRNA抑制HIF-1α在成熟DC的表达时,KIF2A的表达显著上调。结论：1.细胞表面上调表达的CD44能促进乏氧DC引发初始T细胞发生非典型的Th2极化；2. MT1-MMP可促使CD44从细胞表面脱落；乏氧条件下,MT1-MMP在DC的表达下调,CD44从DC表面脱落减少,从而使得DC表面CD44表达增高,而上清中可溶性CD44减少；3.在乏氧条件下,KIF家族中的KIF2A在成熟DC的表达降低；KIF2A siRNA能抑制MT1-MMP在DC的表达,同时其也能直接上调CD44在DC表面的表达；4.乏氧条件下KIF2A在DC的表达受HIF-1α所调控。第三部分乏氧DC功能研究中MHEJ报告系统的建立目的：建立MHEJ这一DNA双链断裂修复方式的细胞基础的检测报告系统,探讨系统本身的可能影响因素,筛选可用于乏氧DC功能研究的MHEJ报告系统。方法：1.将嘌呤霉素乙酰转移酶(puromycin acetyltransferase, Pac;可使细胞具有嘌呤霉素抗性)基因扩增纯化后,酶切,然后在该位点插入一含有I-SceI (TAGGGATAACAGGGTAAT)和AscI (GGCGCGCC)识别位点的18-bp片段,该插入片段的两端分别具有一5-bp或10-bp长的重复序列；在研究插入的长片段对MHEJ影响时,将约lkb长的DNA片段插入含有10-bp重复序列的AscI位点。将这一含有功能失活的Pac基因和重复序列的DNA片段,插入到pIREShyg3质粒中；该质粒同时含有潮霉素B (hygromycin B)基因,能使被转染的细胞具有hygromycin B抗性；2.将含有失活Pac基因的pIREShyg3质粒通过电转的方法,转入人纤维肉瘤细胞株HT1080中；电转2天后,加入hygromycin B筛选；约14天后,挑选成功转入质粒并整合到细胞基因组中的具有hygromycin B抗性的克隆(HT1080MHEJ细胞株)。用Southern blotting检测整合到筛选的HT1080细胞克隆中的报告基因拷贝数；3.将挑选出的含有MHEJ报告基因的HT1080细胞分别种于细胞培养皿中,1天后加入puromycin;同时设不加puromycin的细胞组,用于计算克隆形成效率。puromycin选择9-12天后,将形成的克隆用结晶紫染色,计数；并计算自发性MHEJ的频率；4.用表达I-Scel的pCMV(3xNLS)I-SceI质粒转染只含有1个MHEJ报告基因的HT1080细胞,24小时后将细胞种于培养皿中；用上述puromycin选择法计算I-Scel导致的位点特异性DNA双链断裂中MHEJ的频率。结果：1. hygromycin B筛选14天后,得到了数个含有MHEJ报告基因的HT1080克隆；其中含有5-bp重复序列的克隆有7个,含有10-bp重复序列的克隆有15个,以及12个含有10-bp重复序列及1kb插入片段的克隆；Southern blotting结果表明,筛选出的HT1080克隆基因组中被整合进入了1个或多个(2-5个)拷贝的MHEJ报告基因；2.在自发性MHEJ检测中,在含有5-bp和10-bp重复序列的HT1080MHEJ细胞中均发现了发生自发性MHEJ的细胞集落,这些细胞具有puromycin抗性。在7个含有5-bp重复序列的HT1080MHEJ细胞株中,仅有1个细胞株筛选出具有puromycin抗性的细胞集落(1/7),而在15个含有10-bp重复序列的HT1080MHEJ细胞株中,有7个细胞株中检测到自发性MHEJ的发生(7/15)。含有5-bp重复序列的细胞株平均整合的MHEJ报告基因拷贝数为2.7,含有10-bp重复序列的细胞株整合的平均拷贝数为1.9。唯一一个发生MHEJ的5-bp细胞株中整合了5个拷贝的报告基因,而在7个发生MHEJ的10-bp细胞株中也有6个是具有多个拷贝的MHEJ报告基因的细胞株；3.含有5-bp重复序列的HT1080MHEJ细胞的自发性MHEJ频率平均值为3×10-8,含有10-bp重复序列HT1080MHEJ细胞的自发性MHEJ频率平均值为20×10-8,而同时含有10-bp重复序列和1kb插入片段的HT1080细胞未筛选出发生MHEJ的细胞集落；4. I-SceI转染后,含有5-bp重复序列的HT1080细胞发生MHEJ的频率平均值为1.022×10-3,含有10-bp重复序列的HT1080细胞发生MHEJ的频率平均值为6.444×10-3,而含有10-bp重复序列和1kb插入片段的HT1080细胞的MHEJ发生频率最低,为2.200×10-6。结论：1.成功建立了细胞基础的MHEJ检测报告系统;2.含有10-bp重复序列的HT1080克隆自发性MHEJ的发生频率高于含有5-bp重复序列的克隆,而中间插入lkb片段的10-bp重复序列克隆未检测到自发性MHEJ的发生。这说明,重复序列或微同源序列的大小会影响MHEJ修复的效率,长的重复序列可能能够更为高效的介导MHEJ的发生；在含有同样大小的重复序列时,整合的报告基因拷贝数越多,发生MHEJ的几率越高；而且两个重复序列的接近程度越大,MHEJ越容易发生；3. I-Scel引发的位点特异性DNA双链断裂MHEJ的发生频率高于自发性MHEJ的发生频率；与其他长度的重复序列相比较,10-bp重复序列能够最为有效的介导MHEJ的发生。