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肠粘膜是维持肠道稳态的重要屏障。缺氧（Hypoxia,H）引发小肠上皮屏障功能损伤,修复能力下降,导致肠道疾病的发生。牛乳来源外泌体可以调节肠道健康,其中微小核糖核酸（micro RNAs,miRNAs）被认为是外泌体中潜在重要功能执行者。牦牛作为高原地区的生物,具有耐寒、抗缺氧、抗辐射等特性。我们猜测牦牛乳来源外泌体中miRNA能够缓解肠道缺氧损伤。本研究首先对牦牛乳外泌体（Yak milk exosome,Yak-Exo）提取方法进行优化。在此基础上,探讨分析牦牛乳外泌体调控大鼠小肠隐窝上皮细胞（The intestinal epithelium cells,IEC-6）缺氧损伤的作用,比较牦牛乳与荷斯坦奶牛乳外泌体中miRNA的差异,筛选牦牛乳外泌体中与缺氧相关miRNA。进一步阐明牦牛乳外泌体中bta-miR-31与bta-miR-34a调控IEC-6细胞缺氧损伤的分子机制。主要研究结果如下:1.牦牛乳外泌体提取方法的优化为了深入研究Yak-Exo中miRNA缓解肠道缺氧损伤的作用,首先需要获取高纯度的Yak-Exo。本研究以牦牛乳为研究对象,分别采用传统超高速离心法（Method 1）和凝乳酶辅助优化法（Method 2）提取Yak-Exo。利用透射电镜（TEM）观察比较两种方法提取出的Yak-Exo形态结构特征,结果表明,传统超高速离心法与凝乳酶辅助优化法均可提取出圆形或椭圆形,有脂质膜结构的外泌体。利用马尔文粒径仪测算比较两种方法提取出的Yak-Exo的粒径大小,结果表明,传统超高速离心法提取的Yak-Exo粒径峰值为109.2±57.1nm,凝乳酶辅助优化法提取的Yak-Exo粒径峰值为112.4±48.6 nm。运用蛋白免疫印迹法（WB）检测比较两种方法提取出Yak-Exo表面标志蛋白的表达,结果表明,凝乳酶辅助优化法提取的Yak-Exo表面标志蛋白的表达量高于传统超高速离心法。利用流式细胞术（FC）定量两种不同提取方法所得Yak-Exo数量,结果表明,凝乳酶辅助优化法提取出的Yak-Exo的数量是传统超高速离心法的3倍。2.牦牛乳外泌体缓解小肠上皮细胞缺氧损伤的影响本研究为确定Yak-Exo缓解IEC-6细胞缺氧损伤的分子机制。首先采用凝乳酶辅助优化法分别获取高纯度的牦牛乳外泌体（Yak milk exosome,Yak-Exo）和荷斯坦奶牛乳外泌体（Cow milk exosome,Cow-Exo）。利用马尔文粒径仪检测分析Yak-Exo和Cow-Exo的粒径大小,结果表明,Yak-Exo和Cow-Exo粒径峰值相似,均在131nm左右。运用WB检测比较Yak-Exo和Cow-Exo表面标志蛋白的表达,结果表明,Yak-Exo中TSG101、CD63、Hsp-70蛋白的表达量显著高于Cow-Exo。利用FC定量Yak-Exo和Cow-Exo数量,结果表明,Yak-Exo的数量是Cow-Exo的3.7倍。在此基础上,采用细胞培养箱（5%CO2,95%N2）模拟IEC-6细胞缺氧（Hypoxia,H）损伤。利用噻唑蓝（MTT）法检测添加不同浓度Yak-Exo和Cow-Exo对IEC-6缺氧损伤缓解的影响,结果表明:当添加240 ng/μL的Yak-Exo和Cow-Exo,缺氧处理12h后,与H组相比,Yak-Exo将IEC-6细胞存活率显著增加了29%,而Cow-Exo将IEC-6细胞存活率显著增加了22%。利用激光共聚焦（LCM）检测IEC-6细胞对Yak-Exo和Cow-Exo摄取作用,结果表明,相比Cow-Exo,Yak-Exo可以更多被IEC-6细胞摄取。运用WB检测p53和HIF信号路径元件因子表达,结果表明:添加Yak-Exo会显著抑制p53蛋白、HIF-α及VEGF蛋白的表达,促进PHD-1蛋白的表达。3.牦牛乳与荷斯坦奶牛乳外泌体中miRNA的差异分析与鉴定本研究利用高通量测序对Yak-Exo和Cow-Exo中miRNA表达谱进行分析。结果表明,Cow-Exo和Yak-Exo中共筛选出794个已知的miRNAs,其中存在130个差异的miRNA。与Cow-Exo相比,Yak-Exo中51个miRNAs显著上调,79个miRNAs显著下调。GO富集分析得出,在Yak-Exo中表达上调的51个miRNAs的靶基因主要参与了细胞内通讯传递等多种生物学过程。KEGG富集分析得出,在Yak-Exo中表达上调的51个miRNAs的靶基因中核糖体通路为极显著富集项,富集到79个候选靶基因（P<0.01）。肿瘤坏死因子信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路等为显著富集项（P<0.05）。而缺氧信号通路可以从98个背景基因中富集到58个候选基因（P=0.052）。采用生物学分析综合评估预测结果表明,与Cow-Exo相比,在Yak-Exo显著上调的前20个miRNAs中,bta-miR-31和bta-miR-34a均与缺氧进程相关。4.bta-miR-31/34a缓解小肠上皮细胞缺氧损伤的影响为了探究bta-miR-31和bta-miR-34a缓解IEC-6细胞缺氧损伤的作用机制。分别转染不同浓度过表达bta-miR-31、沉默bta-miR-31、过表达bta-miR-34a和沉默bta-miR-34a,利用qRT-PCR检测miRNA的转染效率,结果表明,bta-miR-31过表达100pmol/well,沉默200pmol/well;bta-miR-34a过表达100pmol/well,沉默200pmol/well转染效果最佳。利用MTT和免疫荧光（IF）检测bta-miR-31和bta-miR-34a对IEC-6细胞存活率的影响,MTT结果表明:与H相比,过表达bta-miR-31和bta-miR-34组均能显著增加细胞的存活率。IF结果表明:与H组相比,过表达bta-miR-31和bta-miR-34a后,Ki67蛋白表达量显著增加。运用WB检测缺氧和细胞凋亡信号路径元件因子表达,结果表明:与H组相比,过表达bta-miR-31和bta-miR-34a会显著抑制p53蛋白表达;显著促进PHD-1蛋白表达,降低HIF-α及下游因子VEGFA蛋白的表达。运用双荧光素酶验证bta-miR-31和bta-miR-34a与Caspase-9之间的靶向关系,结果表明,bta-miR-34a可以调节bta-caspase-9 3’UTR上所选位点调控靶基因的表达。综上所述,凝乳酶辅助优化法能够有效去除牦牛乳中的酪蛋白,高效提取Yak-Exo。Yak-Exo中bta-miR-31和bta-miR-34a通过有效调节缺氧信号通路及细胞凋亡信号通路,缓解缺氧引起的IEC-6细胞损伤。