【摘 要】
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目的:研究血小板衍生生长因子受体β（Platelet-derived growth factor receptor-beta,PDGFRβ）对肾母细胞瘤G401细胞生物学特性的影响及调控有氧糖酵解的具体机制。方法:通过外源性配体PDGF-BB激活或小干扰RNA抑制PDGFRβ,CCK-8实验检测细胞增殖能力,Western blot结合流式细胞术分析细胞周期及周期蛋白的变化,Transwell实验
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目的:研究血小板衍生生长因子受体β（Platelet-derived growth factor receptor-beta,PDGFRβ）对肾母细胞瘤G401细胞生物学特性的影响及调控有氧糖酵解的具体机制。方法:通过外源性配体PDGF-BB激活或小干扰RNA抑制PDGFRβ,CCK-8实验检测细胞增殖能力,Western blot结合流式细胞术分析细胞周期及周期蛋白的变化,Transwell实验和伤口愈合实验检测细胞侵袭迁移能力,Western blot和免疫荧光技术检测EMT相关基因的变化。其次,q RT-PCR结合Western blot检测糖酵解相关酶HK2、PKM2、LDHA和PDK1的表达,酶活性试剂盒检测HK、PK和LDH的活性,根据细胞外葡萄糖和乳酸浓度的变化趋势分析糖代谢水平。Western blot分析PDGFRβ对PI3K/AKT/m TOR通路蛋白的影响。联合使用PDGF-BB与PI3K抑制剂LY-294002、有氧糖酵解抑制剂DCA或PDGFRβ抑制剂Sunitinib,糖代谢实验结合Western blot分析PDGFRβ调控G401细胞有氧糖酵解的具体机制;最后将PDGF-BB与PKM2抑制剂C3K、HK2抑制剂2-DG或PDK1抑制剂DCA联合处理细胞,通过糖代谢实验筛选PDGFRβ调控有氧糖酵解过程中的关键酶,并用所筛选酶的激活剂进一步验证。结果:1.PDGF-BB促进G401细胞增殖,15 ng/m L PDGF-BB促增殖作用最显著;抑制PDGFRβ后,细胞增殖能力降低;2.细胞周期结果显示,PDGF-BB处理G401细胞后,G1期和S期细胞数变化最为明显。进入G1期的细胞数逐渐增多,进入S期细胞数逐渐减少,而G2期在72 h才出现降低趋势。Western blot结果发现,G1期和S期相关蛋白Cyclin E2、CDK2和Cyclin A1表达均上调,提示PDGF-BB可能通过促进G401细胞S期进程来促进细胞增殖;在抑制PDGFRβ后,S期细胞数增多,S期相关蛋白Cyclin A1和CDK2蛋白表达量减少,提示发生S期阻滞;3.PDGF-BB刺激促进G401细胞侵袭迁移,抑制PDGFRβ表达后细胞侵袭迁移能力则降低;4.PDGF-BB刺激后,G401细胞E-cadherin下调,vimentin、snail和α-SMA表达上调,促进EMT进程;抑制PDGFRβ后趋势与之相反;5.糖酵解相关实验表明,PDGFBB促进HK2、PKM2、LDHA和PDK1 m RNA和蛋白的表达,同时提高HK、PK和LDH活性,G401细胞对葡萄糖的利用增多,乳酸生成增多;抑制PDGFRβ后有氧糖酵解相关酶的表达及活性均降低,细胞消耗的葡萄糖减少,乳酸生成也减少;6.PDGF-BB处理细胞后检测PI3K/AKT/m TOR通路蛋白发现,p-PI3K、p-AKT、p-m TOR表达增加,且磷酸化水平随时间逐渐升高;抑制PDGFRβ后磷酸化水平降低。而总的PI3K、AKT、m TOR蛋白均不受影响;7.用LY-294002、DCA和Sunitinib分别预先阻断PI3K通路、有氧糖酵解和PDGFRβ后发现,PDGFRβ可通过PI3K/AKT/m TOR通路来调节有氧糖酵解从而促进肾母细胞瘤EMT进程;8.使用2-DG、C3K和DCA分别预先阻断HK2、PKM2和PDK1后再加PDGF-BB,通过比较分析乳酸和葡萄糖水平发现,预先阻断PKM2后有氧糖酵解受抑制程度最大;9.联合使用PDGFRβ抑制剂Sunitinib、PKM2抑制剂C3K及PKM2激活剂DASA-58处理G401细胞,糖代谢实验发现DASA-58可逆转Sunitinib对G401细胞有氧糖酵解的抑制作用,且C3K和Sunitinib联合使用对有氧糖酵解的抑制作用比两者单独使用的抑制作用大。结论:PDGFRβ可影响肾母细胞瘤G401细胞的生物学特性,且PDGF-BB/PDGFRβ可通过PI3K/AKT/m TOR通路调节有氧糖酵解从而促进肾母细胞瘤EMT进程,其中PKM2是PDGFRβ调控有氧糖酵解途径的关键酶。
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