目的：以往白血病的细胞免疫治疗的细胞来源均为缓解期的白血病患者，未缓解或初治白血病患者外周血存在一定比例的白血病细胞，能否激发出抗肿瘤CIK细胞值得进一步探讨。分别收集缓解期急性白血病患者、未缓解白血病患者的外周血，提取单个核细胞，培养树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞,观察DC细胞与CIK细胞的增殖能力、免疫膜标变化以及抗白血病细胞的效应。混合培育树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞，比较缓解期与未缓解期患者来源的CIK细胞特性变化和杀灭瘤细胞活性，探索生物过继医疗收获效应细胞的较合理方法。方法：DC细胞的培养：采取未缓解期和缓解期急性白血病患者的外周血，经肝素抗凝后，用H-F(Hypaque-Fieoll)淋巴细胞分离液（相对密度为1.077±0.001），分离获得单个核细胞(mononuclearn cells，MNC)。然后用RPMI1640培养液洗涤3次，调整细胞浓度至4×106／ml，孵育4小时后，取贴壁细胞，加入新鲜RPMI l640培养基，轻轻吹打，将瓶壁上细胞吹起，离心洗涤，计数板计数细胞，使细胞浓度为1×106／ml，然后用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养，并加入细胞因子，使重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)浓度为1000U/ml、重组人白细胞介素-4(rhIL-4)浓度为1000U／ml。然后放入培养箱中培育，适时补充培养基和细胞因子，并计数。在DC细胞培养第6天，加重组人肿瘤坏死因子-a(rhTNF-a)，使浓度为1000U／ml，促进DC细胞成熟。CIK细胞的体外培养：同上来源的细胞经过单个核细胞的分离，然后用RPMI1640培养液洗涤3次，调整细胞浓度至4×106／ml，孵育4小时后，收集悬浮的细胞，用含10％小牛血清(fetal calf serum，FBS)RPMI1640液将细胞浓度调整至1×106／ml，经37℃、5％CO2培养，分别于第1天、第2天加入不同的细胞因子，以后隔日更换新的培养液并计数，同时补充加入重组人白细胞介素-2(rh-interleukin-2，rhIL-2)。培育第7天，用台盼蓝排斥法染色DC细胞和CIK细胞，计数活细胞，用完全培养基（含10％胎牛血清的RPMI1640液）调整DC细胞浓度为1×106／ml，CIK细胞浓度为5×106／ml，按照l:5比例混合，继续培养，在培养的第1天、第9天、第12天、第15天收集共培养细胞，计数，测定生物学活性。结果：1缓解组与未缓解组来源的DC-CIK细胞增殖能力的比较通过观察混合培育树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞后，比较缓解组与未缓解组细胞的增生性能、细胞毒性、表面标识分子。在温箱中孵育过的贴壁单个核细胞，经GM-CSF和IL-4诱导成树突状细胞，培育中细胞外形发生鲜明变化，细胞量亦有明显增加。培育第二天细胞体积增长，边缘发出胞浆突起，外形不规整，随着培育时间的延长，细胞边缘突起增多，变长，并成簇成团生长(见图1)。非粘附单个核细胞在多种细胞因子的刺激诱导下，部分淋巴样细胞明显扩增成CIK细胞，并逐渐形成细胞团块；细胞因子诱导的细胞，最初散在均匀分布，个头小，亮而圆，形体较一致（见图2）。在培养的第4天，细胞形态开始呈现出不规则形，并呈团簇生长（见图3）。从培养的第6天起，细胞明显增殖，成丛或以集落状态生长，并悬浮于培养基中（见图4）。随着培养时间延长，细胞丛和细胞集落数增多。在细胞培养的第6天将DC细胞与CIK细胞共培养得DC-CIK细胞，比较各组的免疫表型和生物活性的变化。细胞培养第9天，经台盼蓝排斥法活细胞计数，缓解组DC-CIK细胞的增殖倍数为(16.39±1.89)，未缓解组DC-CIK增生了(17.0±2.16)倍；第12天，缓解组DC-CIK细胞数为原来的(42.6±3.93)倍，未缓解组是原来的(40.2±2.97)倍。第15天，DC-CIK（缓解组）细胞总数为原来的(65.2±1.81)倍，未缓解组细胞数扩增了(65.4±2.56)倍。分析比较同一组细胞的增殖倍数随时间的增加均有统计学意义。（见表1）即两组CIK细胞均在树突状细胞辅助下快速增殖，增殖速度差别不大。镜下可见DC与较多的CIK细胞聚集成团（见图5），呈团块生长。2缓解组与未缓解组来源的DC-CIK细胞分子表型的变化分别收集培养第1天、第9天、12天及15天的两组培养细胞，经流式细胞仪检测细胞表型分析。结果显示：分离细胞当天测得缓解组和未缓解组细胞的免疫表型结果如下:CD3+CD8+细胞分别为(23.4±5.36)%,(21.8±7.32)%，CD3+CD56+细胞分别为(3.81±1.35)%,(4.01±1.63)%。培养的第9天、12天、15天培养物的免疫表型检测结果如下：缓解组CD3+CD8+细胞分别为(53.0±1.58)%,(71.2±2.59)%,(87.5±1.29)%，CD3+CD56+细胞分别为(31.4±1.14)%,(49.0±2.58)%,(63.8±1.98)%；未缓解组CD3+CD8+细胞分别为(54.0±2.98)%,(71.4±1.82)%，(88.6±3.4)%，CD3+CD56+细胞分别为(32.4±2.24)%,(50.0±3.2)%,(66.8±4.1)%（见表2）可见，在DC-CIK的培养过程中，其细胞免疫表型为CD3+CD8+和CD3+CD56+细胞比例明显增高,（p＜0.05），但两组DC-CIK间免疫表型的变化不显著，P值均大于0.05。3缓解组和未缓解组来源DC-CIK细胞杀伤活性比较采集培养15天的DC-CIK细胞做杀伤实验，以缓解期和未缓解期来源的DC-CIK细胞作为效应细胞，K562细胞为靶细胞，在效靶比5:1～20:1范围内，比较两者的杀伤活性。缓解组在效靶比分别为5:1,10:1,20:1所对应的杀伤活性结果为（21.7±4.64）%,（28.9±3.79）%,（42.64±3.25）%，未缓解组取相同的效靶比，相应的杀伤活性分别为（30.40±2.73）%（,42.38±3.20）%,（57.49±2.87）%（见表3）。未缓解组来源的DC-CIK细胞对K562细胞杀伤力略强于缓解组，但经过统计学分析，相同效靶比条件下二者的杀伤力的差异不明显，P值均大于0.05。4未缓解组来源DC-CIK细胞培养前后白血病细胞比较细胞涂片法计数未缓解患者外周血中的原始细胞，培养前平均值为(8.3±3.1)%，流式测得CD34+细胞占(4.23±3.48)%；混合培养一段时间后再涂片观察，显微镜下未见原始细胞，用流式细胞仪检测表达CD34+的细胞比例降至平均(0.1±0.05)%。比较结果，培养后的细胞中原始细胞较培养前明显减少，差异有统计学意义，即P＜0.05。5未缓解组来源DC-CIK细胞杀伤活性的特异性比较收集未缓解组培养的DC-CIK细胞作为效应细胞，分别以K562细胞和冻存的患者单个核细胞为靶细胞，在效靶比5:1～20:1范围内，比较两者的杀伤活性。未缓解组在效靶比分别为5:1,10:1,20:1时对K562细胞的杀伤活性结果为（30.48±2.94）%，（42.66±3.46）%，（57.22±4.23）%，同时检测在相应效靶比下，对冻存的患者的单个核细胞的杀伤为（35.23±3.43）%，（47.65±5.92）%，（67.29±7.95）%，（见表4），经过统计学分析，相同效靶比条件下二者的杀伤力有显著性差异。结论：1应用未缓解患者的外周血单个核细胞,同样可以培养出DC-CIK细胞，与缓解组来源的DC-CIK细胞比较，增殖活性无显著性差异。2未缓解组和缓解组来源的DC-CIK细胞中， CD3+CD8+及CD3+CD56+双阳性细胞比例均有显著提高，两组无显著性差异。3未缓解组和缓解组来源的DC-CIK均对K562细胞具有较强的杀伤作用，但两组差异无统计学意义。4未缓解组来源的DC-CIK细胞的肿瘤细胞杀伤特异性增强，培养后的细胞中未残留白血病细胞。