帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病，其特征性病理改变是黑质多巴胺能神经元进行性死亡，导致正常运动消失，出现运动迟缓或震颤。传统的治疗方法是口服左旋多巴(L-dopa)等药物或实施外科手术。其中，药物治疗的后期疗效下降，其原因与L-dopa对多巴胺能细胞的毒性有关。而神经节苷脂GMl是存在于哺乳类动物神经组织中的一种重要的神经节苷脂，它具有促进神经生长和修复的作用。 目的 PC12细胞为大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤，常作为研究神经细胞凋亡的细胞模型。又由于它所含的受体及递质与黑质多巴胺神经元相似，故可用于PD的细胞模型。L-dopa是临床上治疗PD的常用药物，但长期服用会导致黑质纹状体多巴胺能系统变性，甚至加速病程的进展。实验证明它可能通过细胞凋亡这一条途径损害多巴胺能神经元。 神经节苷脂GMl是位于细胞膜表面的一种含唾液酸的糖鞘脂，主要位于双脂层的外表面。是大多数哺乳动物细胞膜的组成成分，在中枢神经系统中尤为丰富。神经节苷脂GMl的脑保护作用主要在于其对神经细胞膜的保护。本试验以L-dopa处理的PC12细胞为多巴胺能神经元的细胞凋亡模型，应用透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪及免疫组化等技术，观察神经节苷脂GMl对凋亡中的PC12细胞的影响，为神经节苷脂GMl应用于PD的治疗提供相应的理论依据。 方法 1．在透射电镜观察不同浓度组的神经节苷脂GMl和L-dopa作用下PC12的形态，了解神经节苷脂GMl对凋亡中的PC12细胞的超微结构的影响。 2．应用DNA琼脂糖凝胶电泳了解神经节苷脂GMl对凋亡中的PC12细胞生化的影响，明确不同浓度组神经节苷脂GMl作用下PC12细胞的生化改变。 3．利用流式细胞仪技术观察不同浓度组的神经节苷脂GMl和L-dopa作用下PC12细胞凋亡率、细胞周期的变化，明确神经节苷脂GMl与细胞周期、凋亡率的相互关系。 4．通过免疫组化染色，观察神经节苷脂GMl对PC12细胞的Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。了解抗凋亡蛋白和凋亡蛋白表达的相互关系。 第四军医大学硕士学位论文 结果 1．电镜下神经节昔脂GM！作用组24h时后异常细胞较少，而LJopa作用组视野下出现大 量异常细胞，可见典型凋亡特征性改变：胞膜出芽，芽内可见核物质。胞核固缩，染 色质边集，核膜崩解，内质网肿胀、崩溃、自融，可见凋亡小体。 2．流式细胞仪上进行细胞周期分析和DNA含量测定的结果显示：神经节茸脂GM处理 组的凋亡率较L－dopa组的凋亡率显著下降，凋亡率与神经节昔脂GM浓度在一定范围 内成正比。 3．电泳结果可见L－dopa处理后细胞DNA形成了梯状电泳模式，这是发生凋亡的标志。小 剂量神经节昔脂GM处理组有少量电泳带，较大剂量神经节昔脂GM作用组和空白 对照组未见明显的凋亡降解片段。 4．免疫组化染色显示，Ldopa作用组Bcl－2的表达在第3h时就己出现，以后逐渐增加，至 12h时表达量最高，以后下降较为迅速，至48h时表达量几乎为零。而Bax染色亦在3h 出现，6h以后逐渐下降，但下降的幅度较B。12小。神经节昔脂GM处理组细胞中 B。l－2 蛋白表达的变化与前两组相似，但Bax蛋白量明显降低，阳性细胞比例减少。 结论 1．该实验结果表明神经节昔脂GM可以桔抗由 Ldopa诱导的PC细胞凋亡，且呈一定 的量效关系，提示神经节音脂GM可能是通过阻断凋亡途径以保护多巴胺能神经元。 2．该实验利用光镜、透射电镜从形态学证实了神经节昔脂GMI可以抗由L－dopa诱导的 PC细胞凋亡。流式细胞仪的结果也从细胞周期和凋亡率上证实了神经节苔脂GMI 的抗凋亡作用。 3．该实验利用免疫组化染色技术证明神经节昔脂GMI可以抑制Bax蛋白的合成。这证实 了Bcl－2和Bax的表达比例决定了细胞是否发生凋亡，提示凋亡蛋白和抗凋亡蛋白在PD 发病机制中有重要作用。