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羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）为痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属（Parapoxvirus）的代表成员,具有高度的嗜上皮性,是引起绵羊、山羊等动物“口疮”的重要病原,临床上以在感染动物的口、唇等部位皮肤/黏膜出现丘疹、红斑、水疱、脓疱及痂皮为主要特征。该病传染性强,可通过直接和间接接触发生感染,羔羊最为易感,严重影响羔羊的生长性能。绵羊痘病毒（Sheep pox virus,SPPV）为痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒属（Capripoxvirus）成员,其引发的绵羊痘（Sheep pox,SP）是一种急性、热性、高度接触性传染病,主要以在全身部位的皮肤/黏膜形成典型的结节性病变为特征,传染性强,且致死率高。目前,羊口疮和绵羊痘已成为羊群中常见病毒性疾病,严重制约养羊业的发展。鉴于羊口疮和绵羊痘对养羊业的危害较为突出,且目前尚缺乏安全、效果确实的疫苗用于上述两种疾病的防治,因此,本研究开展了针对ORFV、SPPV主要免疫原基因串联DNA疫苗的研究。首先以具有良好免疫原性的ORFV B2L和SPPV P32基因作为候选抗原基因,通过重叠延伸PCR技术,使用自剪切肽P2A的DNA片段将B2L基因和P32基因进行串联,再利用无缝克隆技术克隆至真核表达载体。之后将表达B2L-P2A-P32的重组质粒转染至真核细胞,转染后48 h进行Western Blot分析。结果表明,翻译后的多肽在P2A处发生了自剪切,使得B2L及P32两种蛋白在真核细胞内能够独立表达。为明确pc DNA3.1-B2L-P2A-P32重组疫苗质粒的免疫保护效果及作为疫苗候选株的应用前景,本研究将制备的重组DNA疫苗质粒与佐剂混合后免疫Balb/c小鼠,免疫程序为第0 d首免,第21 d加强免疫,在二免后14 d进行攻毒保护试验。对血清特异性抗体、中和抗体、免疫球蛋白Ig G1和Ig G2a水平的检测结果显示,pc DNA3.1-B2L-P2A-P32重组疫苗质粒联合佐剂免疫能够诱导抗ORFV和SPPV的特异性抗体,以及抗SPPV中和抗体的产生。利用ELISA方法对血清中细胞因子进行检测,结果显示,pc DNA3.1-B2L-P2A-P32重组疫苗质粒联合佐剂免疫组能够诱导较高水平的IFN-γ和IL-4,统计学差异显著。上述结果表明,pc DNA3.1-B2L-P2A-P32重组疫苗质粒与佐剂混合免疫能有效诱导机体的免疫应答反应。动物攻毒保护性试验结果显示,pc DNA3.1-B2L-P2A-P32重组疫苗质粒联合佐剂免疫组能有效降低小鼠肺脏中的病毒载量,该结果表明重组疫苗质粒能够提供良好的免疫保护。综上,ORFV B2L和SPPV P32基因串联表达的重组疫苗质粒有望用于DNA疫苗的制备,为临床上针对羊口疮和绵羊痘的防控提供重要的技术手段。