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FoxO1(ForkheadboxproteinO1),是FoxO亚家族中研究较为深入的成员之一,在调节脂肪细胞分化中发挥重要作用。FoxO1蛋白可以被乙酰化、去乙酰化、磷酸化、去磷酸化等蛋白修饰后,发挥其生物学功能。普遍认为,FoxO1调节脂肪细胞分化的作用是通过与其靶基因PPARγ(Peroxisome proliferator-activated receptor γ)结合发生的,而PPARγ是脂肪细胞分化的关键调节因子。microRNA(miRNA)是单链小分子RNA,虽然它不编码蛋白,却可以与对应的靶基因3’UTR或5’UTR(少数是CDS)结合,促进/抑制靶基因的活性而发挥着重要的作用。对于绵羊FoxO1基因的miRNA调节机制未见报道。本研究旨在预测并验证调节FoxO1基因表达的关键miRNAs及其调节脂肪细胞分化的机制。利用4个在线软件预测与该基因具有潜在靶标关系的miRNAs。用双荧光素酶报告系统检测荧光活性,验证关键miRNAs与FoxO1是否具有靶标关系。用qPCR、Western blotting和油红O染色,分别在mRNA和蛋白水平上检测miRNAs对FoxO1表达的影响以及对绵羊前体脂肪细胞分化的调节作用。主要结果如下:(1)靶基因预测后将各软件预测结果取交集发现有6个miRNAs与FoxO1具有靶标关系。经过进一步筛选,确定miR-142和miR-144为研究对象。miR-142和miR-144种子区序列分别与FoxO1的3’ UTR碱基互补。理论上说明miR-142和miR-144与FoxO1基因具有靶标关系。(2)成功构建了FoxO1-3’ UTR载体。双荧光素酶报告系统系显示,过表达组(共转染pmir-FoxO1和miR-142 mimic)的荧光活性极显著(P<0.01)地低于阴性对照组。与之相似,共转染pmir-FoxO1和miR-144 mimic的过表达组的荧光活性也显著(P<0.05)低于阴性对照组。说明,miR-142和miR-144与FoxO1的3’ UTR区结合,显著抑制了双荧光报告载体的荧光活性。(3)利用qPCR、Western blotting检测发现,绵羊前体脂肪细胞中转染miR-142 mimic(或miR-144 mimic)的过表达组下调了FoxO1 mRNA(P<0.01)及其编码蛋白(P<0.05)的表达。由此证明,miR-142和miR-144负调节FoxO1的表达。(4)qPCR检测PPARγmRNA的表达量发现,miR-142和miR-144促进PPARγ mRNA的表达量。油红O染色发现,miR-142和miR-144均可促进绵羊前体脂肪细胞分化,加快脂滴形成。总的来说,miR-142和miR-144靶向负调节FoxO1的表达,进而通过FoxO1对PPARγ的负调节作用,促进绵羊前体脂肪细胞的分化。