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肠上皮屏障是抵御细菌感染和炎症的主要防御机制,对人和动物的胃肠道健康至关重要。紧密连接蛋白是肠道屏障结构重要的组成部分,在维持屏障完整性方面起着决定性的作用。益生屎肠球菌能够维持肠道稳定性,改善宿主肠道健康。虽然屎肠球菌对肠道屏障的保护作用已经被报道,但其分子机制极其复杂,特别是调控紧密连接蛋白作用机制目前尚不清楚。本研究以LPS诱导紧密连接损伤的IPEC-J2细胞为模型,探究益生屎肠球菌HDRs Ef1对紧密连接蛋白ZO-1的表达调控作用及机制,为益生菌对肠道紧密连接蛋白的表达调控提供理论基础,为益生菌预防和治疗动物胃肠道疾病提供技术支持。主要研究内容与结果如下:1.LPS、HDRs Ef1对IPEC-J2细胞ZO-1表达的影响（1）LPS对IPEC-J2细胞ZO-1表达的影响。建立LPS诱导的肠上皮细胞损伤模型,采用q RT-PCR法检测LPS对ZO-1 m RNA表达水平的影响以确定LPS最佳作用浓度和时间。结果显示LPS显著下调ZO-1的表达,具有一定的浓度依赖性。（2）HDRs Ef1对IPEC-J2细胞ZO-1表达的影响。采用CCK8法检测HDRs Ef1对IPEC-J2细胞是否具有细胞毒性作用,结果显示10~7CFU/m L的HDRs Ef1活菌与IPEC-J2细胞共培养8 h内不会产生细胞毒性。采用q RT-PCR和Western blot分析HDRs Ef1对ZO-1表达水平的影响,结果显示HDRs Ef1对LPS下调ZO-1的表达具有缓解作用。采用细胞免疫荧光试验检测HDRs Ef1和LPS对ZO-1结构形态的影响,结果显示HDRs Ef1能够抑制LPS对ZO-1结构的破坏作用。因此HDRs Ef1能够抑制LPS对ZO-1表达和结构的破坏作用。2.HDRs Ef1对LPS诱导ZO-1下调作用机制的研究（1）转录因子AP-1对ZO-1表达调控的影响。采用q RT-PCR法检测HDRs Ef1和LPS对转录因子的影响,确定参与调控的转录因子,结果显示AP-1可能参与ZO-1的表达调控。通过基因超表达试验和RNA干扰试验分析AP-1对ZO-1调控的作用,结果显示AP-1过表达可以抑制ZO-1的表达,AP-1基因干扰可以升高ZO-1的表达。因此AP-1能够参与ZO-1的表达调控。（2）JNK/MKK7/ASK1通路对HDRs Ef1缓解LPS下调ZO-1表达机制研究。采用Western blot检测AP-1的上游JNK激活情况,结果表明HDRs Ef1能够抑制LPS诱导的JNK磷酸化。通过加入JNK抑制剂（SP600125）和基因干扰试验检测HDRs Ef1是否通过该通路调控ZO-1的表达,结果显示JNK通路阻断后,ZO-1表达量升高,并且缓解LPS下调ZO-1的表达。因此HDRs Ef1是通过抑制JNK途径来稳定ZO-1的表达,并且HDRs Ef1缓解LPS上调AP-1的表达也依赖于JNK途径。采用Western blot和基因干扰试验检测JNK上游因子是否参与HDRs Ef1对ZO-1的调控,结果显示HDRs Ef1能够抑制LPS诱导的MKK7、ASK1磷酸化。MKK7、ASK1基因干扰后,ZO-1的表达上调,并且能够显著抑制LPS下调ZO-1的表达。因此HDRs Ef1通过抑制JNK/MKK7/ASK1通路抑制LPS诱导ZO-1的下调。（3）TLRs对HDRs Ef1缓解LPS下调ZO-1表达机制研究。采用q RT-PCR法检测TLRs是否在HDRs Ef1调控ZO-1表达中发挥作用,结果显示LPS处理后,TLR2表达量显著下调,而TLR4表达量显著上调;当HDRs Ef1处理后,TLR2、TLR4表达量均显著上调,并且能够缓解LPS下调TLR2的作用。通过RNA干扰试验分析TLR2/4的作用,结果显示TLR2和TLR4基因干扰后,能够抑制HDRs Ef1缓解LPS下调ZO-1的作用。因此HDRs Ef1通过TLR2/4通路抑制LPS诱导ZO-1的下调。（4）TNF-α对HDRs Ef1缓解LPS下调ZO-1表达机制研究。采用q RT-PCR法检测HDRs Ef1对炎症因子的影响,结果显示HDRs Ef1能够抑制LPS诱导炎症因子上调的作用。通过q RT-PCR法和Western blot检测炎症因子刺激IPEC-J2细胞对ZO-1表达量的影响,结果显示IL-6和TNF-α能够下调ZO-1的表达量,但HDRs Ef1仅缓解TNF-α下调的作用。通过RNA干扰试验检测HDRs Ef1是否通过TLR4抑制LPS诱导TNF-α的表达,结果显示HDRs Ef1能够通过抑制TLR4缓解LPS诱导TNF-α的产生。因此HDRs Ef1通过TLR4抑制TNF-α诱导ZO-1的下调。综上所述:HDRs Ef1能够抑制LPS下调ZO-1的表达以及稳定ZO-1网格结构。HDRs Ef1通过TLR2/4信号传导,从而抑制LPS诱导的ASK1/MKK7/JNK/AP-1级联反应来稳定ZO-1的表达。此外,HDRs Ef1能够抑制TNF-α诱导的ZO-1下调,并且可能是通过抑制TLR4来缓解LPS诱导TNF-α的产生。