红花MADS-box基因家族生物信息学分析及CtMADS24调控功能研究

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红花是一种传统的中药材,有极高的经济价值及药用价值。在长期的栽培过程中红花的花球中小花的分化速度及败育现象直接影响了种子产量,通过促进小花的正常发育成为提高其产量的方法之一。截至目前,红花开花进程及花器官形成的分子机制尚不明确。MADS-box家族基因在调控植物开花进程中发挥关键作用,红花MADS-box家族成员的数目、分类及在其开花进程中存在的功能仍鲜见报道。本研究依据红花基因组测序数据对红花MADS-box家族进化特征、基因结构、蛋白保守结构域等关键信息进行预测,利用q RTPCR及RNA-seq技术对红花花瓣的不同发育阶段及不同花器官表达模式进行分析,并通过上述方法挖掘到红花MADS-box家族AP1/FUL亚家族成员CtMADS24,对其在植物中进行功能验证并探究CtMADS24与红花成花转换及花器官建成的调控关系。主要取得以下研究成果:1.利用生物信息学鉴定出红花基因组中77个MADS-box成员,并将其分为两个大类,15个亚家族,氨基酸结构及基因结构分析表明亚家族成员间具有较高的结构保守性,而GO注释提示红花MADS-box蛋白功能较为复杂且多具有典型的转录因子调控功能。2.对MADS-box家族77个基因上游2000bp启动子区域的顺式作用元件分析,揭示了该家族基因可能存在的调控关系,并利用q RT-PCR及RNA-seq技术对红花不同花发育阶段及花发育初期的花器官表达模式进行研究,结果表明不同亚家族基因在花器官表达模式上存在特异性,结合生物信息学及表达分析结果,挖掘到红花MADS-box家族AP1/FUL亚家族在花发育全时期表达水平较高且在萼片发育初期存在特异性表达的基因CtMADS24。3.利用基因沉默技术及拟南芥遗传转化对CtMADS24基因进行功能验证,并对下游相关基因的表达模式及生长素含量进行测定,结果表明CtMADS24在拟南芥过表达引起部分花器官发育特征基因表达水平上调,导致了开花时间缩短,莲座叶数目减少且内源生长素含量下降;而沉默株系红花开花明显延迟,内源生长素含量上升,提示CtMADS24可正向调控花发育,但会抑制植物营养发育。4.通过在烟草中瞬时转化CtMADS24-GFP蛋白,明确了CtMADS24的核定位特征,并利用酵母单杂交及双荧光素酶报告系统验证了CtMADS24对CAr G元件的结合活性。5.成功克隆CtMADS24编码区上游1933bp的启动子区域,对pro CtMADS24上可能存在的转录因子结合位点进行预测,并验证了CtWRC、CtARF与CtMADS24间存在调控作用,为深入研究红花开花转换及花器官建成的分子机制提供理论支持。
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