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A型流感是由A型流感病毒引起的一种重要的人畜共患病,不仅给养禽业造成巨大经济损失,而且有些亚型流感病毒甚至突破种间屏障,具有了感染人的能力,对人类健康和发展也存在重大威胁。因此,研究病毒-宿主相互作用关系对发展有效抗病毒策略具有重要意义。病毒感染宿主涉及一系列复杂的生理生化过程,细胞自噬作为一种高度保守的细胞内降解过程,在病毒感染过程中发挥着重要的抗病毒作用。细胞自噬除了能够通过其吞噬作用直接参与病原体清除保护感染细胞外,还能介导与病原体清除相关的先天性和适应性免疫活动的发生,而病毒为自身存活在长期的进化过程中也具有了逃避宿主抗病毒自噬机制的能力。鉴于此,病毒感染和自噬之间的相互调控关系引起了越来越多人的关注。流感病毒M2蛋白是由病毒第七节段编码的一种跨膜蛋白,其离子通道活性可以促进病毒感染早期vRNP复合体从M1蛋白解离及释放,并在病毒组装和出芽过程中发挥重要作用。为进一步研究流感病毒M2蛋白与细胞自噬的相互作用关系,本实验构建了GFP-LC3和pCAF-M2重组质粒,共转染293T细胞,并通过激光共聚焦和western blot方法检测M2转染细胞自噬体水平。通过进一步的LC3-II turnover试验、mRFP-GFP-LC3双荧光指示系统以及GFP-LC3与LAMP1的共定位观察检测细胞自噬流水平。结果表明,流感病毒M2蛋白能够诱导转染细胞内自噬体积累,而且M2蛋白是通过抑制自噬体与溶酶体融合诱导自噬体积累的。在自噬过程中,细胞内可形成三种Beclin1复合体,作用于自噬不同阶段,其中Beclin1-UVRAG复合体介导自噬体与溶酶体融合。为探索M2蛋白是否是通过与Beclin1蛋白相互作用影响Beclin1-UVRAG复合体形成而抑制自噬体与溶酶体融合,本实验构建了自噬相关蛋白Beclin1和UVRAG的重组表达质粒,并与M2重组质粒共转染细胞,通过免疫共沉淀实验研究三者之间的相互作用关系。结果表明Beclin1蛋白与M2蛋白存在相互作用,但梯度增加M2重组质粒转染量对Beclin1蛋白与UVRAG蛋白的相互作用影响不明显,说明M2蛋白抑制自噬体与溶酶体融合可能有其它机制存在。为进一步探索M2蛋白抑制自噬体成熟的作用机制,我们将M2蛋白进行截短表达和氨基酸缺失,并通过激光共聚焦和western blot方法检测各截短表达体对自噬体水平的影响。将M2蛋白第35-45位氨基酸缺失后发现LC3点状聚集现象明显减弱,表明M2蛋白跨膜区35-45位氨基酸对M2蛋白抑制自噬体与溶酶体融合具有重要作用。将35-45位氨基酸分别单个缺失,发现缺失41位色氨酸后自噬现象减弱,但效果不如35-45位氨基酸整体缺失明显。