球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)是具有代表性的昆虫病原真菌,目前被广泛用于农林害虫的生物防治。生防真菌制剂即真菌杀虫剂的有效成份都是活体细胞,其田间防效及稳定性常受环境温度、湿度、光照、化学农药等多种因素的制约,使真菌杀虫剂的应用受到作物环境或季节性的限制。由于生防真菌具有独特的体壁侵染方式,细胞壁作为真菌细胞的第一道屏障,在生防真菌的抗逆及害虫侵染过程中发挥着重要作用。为此,本论文围绕生防真菌胞壁完整性的主线,运用基因敲除手段对球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌胞壁完整性信号通路及胞壁合成相关的20种蛋白的功能进行了分析,旨在揭示它们在生防真菌复杂抗逆和寄主侵染过程中扮演的角色,以深化生防真菌胞壁完整性与抗逆及毒力性状之间如何相互关联的科学认识。主要研究内容及成果分述如下：球孢白僵菌胞壁完整性信号通路相关激酶的功能分析Bckl、Mkk1和Slt2分别是在酵母中调控细胞壁完整性信号通路[cell wall integrity (CWI) pathway]的三个有丝分裂原活化的蛋白级联激酶MAPKKK、MAPKK及MAPK,其通过与高渗透压调节(HOG)信号通路的交联作用参与真菌的应激反应。球孢白僵菌野生菌株Bb2860中也存在Bckl、Mkk1和Slt2的同源蛋白激酶,通过对单基因敲除获得的三个敲除菌株Δbck1、Δmkkl和Δslt2的菌丝和分生孢子进行多方面的表型分析,发现它们的细胞壁均严重受损,从而确认Bckl、Mkk1和Slt2同样调节球孢白僵菌的胞壁完整性,显示它们在该信号通路中的功能保守性基本特征。然而,三个敲除菌株对高渗透剂NaCl和山梨醇也十分敏感,Western杂交结果显示在高渗胁迫下各敲除株Hogl的磷酸化水平大大减弱甚或消失,说明Bckl、Mkk1和Slt2在球孢白僵菌中与高渗透压信号通路[high-osmolarity glycerol (HOG) pathway]中的同伴之间存在功能对话。此外,敲除突变株在富营养条件下辐射生长更快、产孢提前,对贫瘠营养条件、杀菌剂、高温以及UV-B辐射的敏感性增强,分生孢子对大蜡螟幼虫的毒力大幅减弱,并伴随胞内甘露醇和海藻糖含量的显著下降,但各敲除株的抗氧化能力都无明显变化。其中,△mkkl和△slt2对高温以外的所有胁迫都比野生株更敏感,二者的多数胁迫反应相似并在一定程度上与△bckl有所区别。敲除株的所有表型缺陷均能在相应回补菌株中得到恢复。由此证明,CWI通路中的Bckl、Mkk1和Slt2与HOG通路相互协作调控球孢白僵菌的多胁迫反应即抗逆力,并影响致病力,因而在该菌生防潜能的维系中是不可或缺的。GPI锚定蛋白Ecm33的功能比较Ecm33是酵母中的一类糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白[glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchored proteins],主要参与胞壁完整性的调控,但其对丝状真菌抗逆性状的贡献知之寥寥。蛋白序列比对分析揭示,球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌各拥有Ecm33的一个同源蛋白,分别记为Bbecm33和Mrecm33。结构预测和胶体金免疫定位证明它们是GPI锚定的胞壁蛋白而不是质膜蛋白。两个蛋白的单基因敲除菌株仅表现轻微的生长缺陷,但其分生孢子产量却分别大幅下降76%和42%,并伴随胞内甘露醇和海藻糖含量的显著降低,但糖分子表面抗原的变化仅发生在ΔBbecm33中。在各种胁迫反应中,ΔBbecm33抗刚果红和SDS胞壁干扰的能力远弱于ΔMrecm33,后者甚至不受SDS干扰剂的影响；两个敲除株的菌丝对氧化剂(甲萘醌和H2O2)、杀菌剂(多菌灵和乙菌定)、高渗剂NaCl以及Ca2+胁迫的耐受性也显著降低。此外,ΔBbecm33分生孢子抗UV-B紫外辐射的能力下降达55%,而ΔMrecm33却几乎不受影响,但二者分生孢子的耐高温能力下降幅度相近(25～28%)。所有表型差异都能在各基因的回补菌株中得到良好恢复。然而,ΔBbecm33和ΔMrecm33对易感宿主昆虫的毒力均无显著变化。总体看,Ecm33对产孢和多胁迫抗应激反应的调控作用,在球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌之间存在胁迫反应类型和程度上的差异。胞壁合成蛋白磷酸酶Ssd1的功能比较Ssd1是分布于细胞质中具有RNA结合区域和核糖核酸外切酶催化区域的功能蛋白,参与真菌细胞完整性、生命周期及致病性的调控。球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌中分别存在Ssdl的同源基因Bbssdl和Mrssdl。胶体金免疫定位证明二者分布在宿主菌的细胞质中。通过构建单基因敲除株和多表型分析,发现Bbssd1和Mrssdl参与真菌的生长、细胞分化、产孢的调控,并且影响分生孢子活力,因为二者的分生孢子产量显著下降,孢子萌发较缓慢。在多胁迫反应中,ΔBbssdl和ΔMrssdl表现出对胞壁干扰、氧化、高渗、杀菌剂、高温及UV-B辐射的高度敏感性,对斜纹夜蛾和黄粉虫的毒力也显著下降。两个敲除株的胞壁完整性均受到损伤,在凝集素标记反应中突变株细胞壁组分与野生株差异显著,但二者影响胞壁组分的内在机制却不相同,表现为凝集素标记反应的结果方向相反。关联基因转录水平的分析在一定程度上揭示了两个突变株胞壁成分的不同变化。因此,球孢白僵菌和罗伯茨绿僵菌的Ssd1均参与调控一些胞壁成份的合成,因而对胞壁完整性、真菌抗逆力及致病力具有重要意义。WSC结构蛋白的功能分析WSC (water-soluble carbohydrate)结构域是广泛存在于真菌跨膜蛋白中的特殊结构,由8个以上半胱氨酸残基组成,主要分布在CWI信号通路上游应激响应元件WSC蛋白家族中,也存在于β-1,3-外切葡聚糖酶等蛋白中。在已注释的球孢白僵菌的基因组中有13个包含WSC结构域的蛋白,命名为Wsc1-13。通过构建各WSC蛋白的单基因缺失突变株及多表型分析,发现这13个WSC蛋白对维持细胞壁的完整性和细胞功能十分重要。其中,Wsc1、Wsc2和Wsc4主要影响真菌的生长,Wsc3和Wsc4还参与调控产孢。各突变菌株对荧光增白剂、刚果红、SDS以及咖啡因的胁迫均表现高度敏感,大多数WSC蛋白还参与调控抗氧化、耐高渗、抗金属离子、抗杀菌剂以及耐碱性环境的胁迫反应,而且各蛋白间既有部分功能性重叠又存在多样性变化。不仅如此,Wsc2-5和Wsc8对球孢白僵菌的耐高温能力具有显著贡献,而所有13个敲除株耐UV-B紫外辐射的能力均显著下降。在对大蜡螟的毒力测定中,除Awsc6和△wsc12之外的敲除株经体壁侵染的毒力也显著下降,但经血腔注射侵染的毒力都不受到显著影响,说明大多数WSC蛋白在球孢白僵菌侵入寄主体壁的过程中发挥着生物学作用。