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胃出血是常见的危重消化道疾病,由于胃出血点所处环境特殊,强酸性的胃液和高活性的胃蛋白酶使凝血酶无法发挥作用,因此,抑制胃蛋白酶活性为治疗该类疾病的关键;此外,胃出血患者血清中的胃蛋白酶含量远高于正常人,用特异性的结合物检测血清胃蛋白酶变化,亦是临床无痛诊断胃出血疾病的有效手段。核酸类适配子为一些具有高级结构的单链DNA或RNA的寡核苷酸链,因其性质稳定、以高特异性和高亲和力与靶物质结合,目前已在临床上用于诊断和治疗各种疾病。本文旨在利用指数富集配基系统的进化技术(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),将与磁珠偶联的胃蛋白酶作为靶分子,从体外80 nt(nucleotide)的随机寡核苷酸(DNA)文库中,筛选鉴定出与胃蛋白酶特异性结合的适配子:然后将适配子上标记生物素分子,建立胃蛋白酶的ELADA(Enzyme-linked aptamer direct assay)检测方法;并筛选出抑制胃蛋白酶功能位点适配子,为胃出血症的临床诊断和应用奠定基础。研究结果如下:1.将1mg/mL胃蛋白酶包被于Dynal磁珠,并用BCA(考马斯亮蓝)法检测胃蛋白酶的包被效率。包被完成后,未被包被的胃蛋白酶浓度仅为0.0191mg/mL,即98.09%的胃蛋白酶偶联到磁珠上,这使适配子筛选具有可行性。2.在体外设计一个两端各为20 nt,中间为40 nt的初始文库。80 nt的ssDNA经3%琼脂糖凝胶电泳后,条带的位置大概在核酸marker的50 bp附近;经过PCR扩增后,80 bp的dsDNA电泳条带的位置在的核酸marker的100 bp附近。3.通过梯度PCR反应,确定PCR扩增过程中具体参数。对称PCR技术的最佳反应条件是:退火温度58℃,循环次数30次;而不对称PCR技术的循环次数为40,最佳的引物比为P1:P2=100:1。4.以偶联到磁珠的胃蛋白酶为靶标,采用磁珠分离,通过磁力架分离与胃蛋白酶结合和未结合的ssDNA,整个筛选一共进行13轮,首次筛选时,ssDNA与胃蛋白酶的结合率只有1.48%,随着筛选次数的增多,ssDNA与胃蛋白酶结合率逐渐升高,第13次的适配子结合率最高,为73.57%,说明已经成功筛选到胃蛋白酶的候ssDNA选适配子。5.将第13轮筛选产物分别进行扩增、纯化、TA克隆、“蓝白”斑选择、测序等一系列操作,有27条序列被测出。除去中间随机序列的碱基数不足40个碱基的序列,最终成功得到8条可能的胃蛋白酶适配子(序号分别为NO.1,NO.5,NO.6,NO.9,NO.11,NO.15,NO.21,NO.26)。6.分析候选适配子的一级和二级结构,发现这8条适配子的一级结构同源性仅为43.3%,二级结构主要为茎环结构。7.用药典2000方法测定适配子对胃蛋白酶的抑制情况,结果表明8条适配子中仅有3条适配子(NO.5,NO.6,NO.21)对胃蛋白酶活性有较高的抑制作用。测定3条适配子半抑制浓度,得出21号适配子对胃蛋白酶的抑制率最高。8.生物素标记适配子,依照胃蛋白酶(其他蛋白质)-适配子-生物素-亲合素-辣根过氧化酶-底物结合反应步骤,应用ELADA方法测定不同蛋白质与适配子的结合情况。发现这3条适配子只对胃蛋白酶有很高的特异性(显著性p<0.01),其中21号适配子的特异性最强。结论:本研究基于指数富集配基的系统进化(SELEX)技术,以磁珠作为介质进行适配子分离,在中间过程中加入反筛,有效减少非特异性结合,经十三轮筛选,筛选出针对胃蛋白酶的ssDNA适配子,在国内外尚属首次;运用药典2000方法,鉴定适配子对胃蛋白酶活力的抑制作用,同时建立胃蛋白酶适配子特异性检测方法,验证筛选到特异性和抑制率都最高的21号适配子。这些结果为后期研究胃蛋白酶的ssDNA适配子对胃出血治疗和诊断提供一定基础。