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研究背景:慢性乙肝是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus,HBV）引起的,以肝脏炎性病变为主的一类常见疾病。我国是慢性肝炎特别是乙型肝炎（HBV-induced chronic hepatitis,HB）的高流行区,约2%10%的患者可转化为肝硬化（Hepatic Cirrhosis,HC）。目前,HC的各种检测方法分别受其技术特点的限制,分别存在特异性低、取样不便和不能早期诊断等缺陷。本实验室在前期研究中采用凝集素芯片检测技术,分析了491例HBV诱发的肝炎、肝硬化和肝癌患者和156例健康志愿者（Healthy Volunteer,HV）的唾液样本,有14个凝集素（例如MAL-II,UEA-I和DSA）显示了它们识别的唾液糖蛋白糖型在肝病发生发展过程中发生了显著变化,制备出了一款针对HBV诱发的肝病检测的小型凝集素芯片,并构建了数学诊断模型。本研究首先运用这款凝集素芯片进行盲测,验证数学诊断模型的准确性,并采用唾液芯片和DSA凝集素印迹技术验证肝病患者唾液中的糖蛋白糖链结构的差异,最后利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF/TOF-MS）进一步解析DSA识别的唾液糖蛋白中N-乙酰葡萄糖胺（β-D-GlcNAc）糖基化的N-/O-聚糖结构。实验方法:利用针对HBV诱发的肝病检测小型凝集素芯片对收集的104例受试者的唾液样本进行盲测,对建立的HC和HCC诊断数学模型进行评估;通过唾液芯片验证DSA识别的唾液糖蛋白糖链结构在HC患者中高表达,制备凝集素DSA-磁性微粒复合物,分别分离纯化出HV,HB,HC和HCC患者唾液中的糖蛋白,用SDS-PAGE硝酸银染色和凝集素印迹技术进行验证;最后用PNGase-F酶切法/NaClO氧化法分别分离糖蛋白上的N-/O-连接糖链,并利用MALDI-TOF/TOF-MS进一步解析糖链结构。实验结果:通过分析104例受试者唾液样本的盲测结果发现,Model HC能够正确区分52例HC中的48例,阳性率为92.3%（48/52）,50例HCC中的9例被误诊为HC,2例HB均被误诊为HC,假阳性率为21.2%（11/52）,综合准确率达到85.6%（89/104）;Model HCC能够正确区分50例HCC中的41例,检测阳性率为82.0%（41/50）,52例HC中的4例被误诊为HCC,假阳性率为7.41%（4/54）,综合准确率达到87.5%（91/104）;唾液芯片中HV,HB,HC和HCC四组的归一化荧光强度值通过组间Ordinary One-Way ANOVA Analysis统计学分析,发现相较于HV组,凝集素DSA所识别的糖链结构在HB（p=0.0021）,HC（p<0.0001）和HCC（p=0.0320）组中均显著表达增加,值得注意的是,相较于HV组（p<0.0001）,HB组（p=0.0216）和HCC组（p=0.0013）,凝集素DSA特异识别的糖链结构在HC组中表达最高;SDS-PAGE硝酸银染色和凝集素印迹实验结果验证了凝集素DSA特异性识别的糖链结构在HC组的唾液蛋白中表达增多;质谱结果显示,从HV,HB,HC和HCC四组样本中总共鉴定到了61/46种N-/O-连接糖链,各组中依次获得了24/24,16/26,36/25和27/22种N-/O-连接糖链,而各组中含有凝集素DSA特异性识别的糖链结构的N-/O-连接糖链分别有9/7,7/8,15/6,13/8种,并且有9种N-连接糖链特异性的仅存在于HC组中（m/z 1752.618（Fuc）2（Gal）1（GlcNAc）1（Man）1+（Man）3（GlcNAc）2,m/z 2006.732（Gal）3（GlcNAc）3+（Man）3（GlcNAc）2,m/z2136.795（Fuc）2（GalNAc）1（Gal）2（GlcNAc）2+（Man）3（GlcNAc）2,m/z 2371.864（Gal）4（GlcNAc）4+（Man）3（GlcNAc）2,m/z 2402.858（NeuAc）1（Fuc）1（Gal）2（GlcNAc）2（Man）2+（Man）3（GlcNAc）2,m/z 2424.840（Fuc）1（NeuAc）1（Gal）2（GlcNAc）2（Man）2+（Man）3（GlcNAc）2,m/z 2574.943（Gal）4（GlcNAc）5+（Man）3（GlcNAc）2,m/z 2705.006（Fuc）2（Gal）3（GalNAc）1（GlcNAc）4+（Man）3（GlcNAc）2,m/z 2993.052（Fuc）1（NeuAc）1（Gal）5（GlcNAc）4+（Man）3（GlcNAc）2）。综上所述,随着肝病的发展,肝硬化患者的唾液蛋白存在明显的N-乙酰葡萄糖胺糖基化升高现象,有望以此为HC的筛查、早期诊断、风险评估、药物筛选和/或疗效评估提供新方法。