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棉花是天然的纤维和油料作物,具有很高的民用价值和商用价值,是全球重要的经济作物之一。基因工程和细胞工程技术迅速发展,转基因遗传育种成为改良棉花品种的重要技术手段,棉花体细胞胚胎发生是实现转基因棉花育种的主要途径之一,脱落酸作为重要的植物生长调节剂在棉花体细胞胚胎发生中起重要调控作用。该试验以MSB培养基、愈伤诱导培养基和胚性愈伤诱导培养基为基础培养基,设置梯度浓度的外源脱落酸处理棉花下胚轴。通过形态学观察、石蜡切片观察、数据统计和qRT-PCR等方法系统研究了脱落酸对棉花体细胞胚胎发生愈伤诱导和胚性愈伤诱导的影响。试验明确了综合诱导效果最优的脱落酸浓度并分析了脱落酸调控与体细胞胚胎发生Marker基因时空性诱导表达的关系,主要研究结果如下:1.脱落酸促进棉花愈伤组织起始。棉花下胚轴在MSB培养基培养至5 d时已脱分化产生愈伤组织,随着ABA浓度的增加,愈伤组织细胞数量增多。利用qRT-PCR检测5 d时愈伤组织中LBD基因的表达水平,与不添加ABA相比,ABA处理下愈伤组织中GhLBD1 6和GhLBD29相对表达量显著上调,推测外源ABA通过影响GhLBD16和GhLBD29的表达促进愈伤组织起始。2.脱落酸显著提高愈伤脱分化率(Callus dedifferentiation rate,CDR),促进棉花愈伤脱分化。以MSB为基础培养基,培养至20 d时,对照组CDR为15%,ABA处理组CDR为71.7%-84.2%。以愈伤诱导培养基为基础培养基,培养至5 d时,对照组CDR为90%,ABA处理组CDR为90.8%-95.8%。结果证明,单独作用时,0.02μM-0.08 μM的ABA能显著提高CDR;与植物生长素共同作用时,0.2μM-0.8μM的ABA 提高 CDR。3.脱落酸显著提高愈伤增殖率(Callus proliferation rate,CPR),促进棉花愈伤增殖。以MSB为基础培养基,培养至20 d时,对照组CPR为3.8,ABA处理组CPR为6.2-6.9;30 d时,对照组CPR为10.2,ABA处理组CPR为13.1-16.1。以愈伤诱导培养基为基础培养基,10 d时对照组CPR为3.5,ABA处理组CPR为4.3-6.2;20 d时对照组CPR为11.4,ABA处理组CPR为15.7-20.5;30 d时对照组CPR为24.7,ABA处理组CPR依次30.3-37.1。结果证明,外源脱落酸在0 μM-0.8μM的较大浓度范围内均显著促进愈伤增殖,且不依赖于植物生长素。4.低浓度脱落酸促进胚性愈伤分化,高浓度脱落酸降低胚性愈伤分化。统计胚性愈伤分化率(Embryogenic callus dedifferentiation rate,ECDR)和胚性愈伤增殖率(Embryogenic callus proliferation rate,ECPR)。在 MSB 上培养 35 d 时,对照组 ECDR为7%,ABA处理组ECDR为3%-19%;45 d时,对照组ECPR为23.0,ABA处理后ECPR为32.2-36.5。以胚性愈伤诱导培养基为基础培养基,45 d时,对照组ECDR为 89.6%,ABA 处理组 ECDR 为 24.0%-59.4%;55 d 时,对照组 ECDR 为 89.6%,ABA处理组ECDR为24.6%-65.3%。低浓度(0.02μM)ABA处理,胚性愈伤组织呈淡黄色、疏松、分散的优良状态,高浓度(0.04μM-0.8μM)ABA处理,胚性愈伤组织随着ABA浓度升高,逐渐呈现稀软、发黑的不良状态。5.脱落酸调控体胚发生相关的Marker基因的表达控制愈伤增殖和分化。愈伤增殖阶段早期(15 d),ABA促进BBM基因上调,对LEC1基因的表达没有影响,抑制AGL15基因的表达。愈伤增殖中期(20 d),ABA同时诱导BBM、LEC1和AGL15基因的表达。愈伤增殖后期(30 d),ABA显著诱导FUS3、LEA、ABI3基因的表达。综上所述,外源ABA处理对体胚发生相关Marker基因的诱导具有时空特异性,愈伤增殖早期和中期主要调控BBM、LEC1和AGL15的表达,愈伤增殖后期主要调控FUS3、LEA、ABI3基因的表达,这些体胚发生相关基因表达水平的增加是ABA调控愈伤增殖和分化的基础。试验结果表明:脱落酸能显著促进愈伤起始,提高愈伤脱分化率和增殖率,低浓度脱落酸(0.02 μM)提高胚性愈伤分化率,高浓度脱落酸抑制胚性愈伤分化,且脱落酸的调控作用与体细胞胚胎发生Marker基因的时空性诱导表达密切相关。试验为脱落酸在棉花体胚发生体系完善中的应用提供了参考,为深入解析脱落酸在体胚发生中的作用机制提供了基础。