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研究背景及目的:随着眼科学的发展,角膜移植手术已成为目前最常见的移植手术之一。人类角膜移植具有非常高的存活率,在无血管植床进行角膜移植的2年存活率可高达90％以上。然而,在血管化植床进行的角膜移植,其成功率较低。事实上,这些“高危”患者的移植排斥率与其他器官移植(如肾脏、心脏和肝脏)的排斥率相差无几。以此,对于整体角膜移植来说,免疫排斥反应仍是角膜移植失败的最主要因为。
大量的研究工作已证实,角膜免疫排斥反应主要是T淋巴细胞介导的迟发型超敏反应。T淋巴细胞的激活通常需要两个信号刺激:一个是T淋巴细胞通过其表面的T淋巴细胞受体(T cell receptor,TCR)识别抗原递呈细胞(antigen-presenting cell,APC)递呈的抗原肽,即主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex,MHC)；另一个是非MHC限制的协同刺激信号,即APC上的诱导性共刺激分子(inducible costimulator molecule,ICOS)与T淋巴细胞表面相应受体的结合。目前己发现的共刺激分子包括:B7/CD28超家族、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)/TNF受体(TNF receptor,TNFR)超家族。现在的B7家族包括3组7个成员,第1组:B7-1(CD80)、B7-2(CD86),受体是CD28分子或CTLA-4(CD152)以及可诱导ICOS；第2组:B7-H1/PD-L1(CD274)、B7-DC/PD-L2(CD73)、B7-H2/ICOS-L,前两个刺激分子的受体是程序性死亡分子(programmed death,PD)-1,B7-H2的受体为ICOS:第3组:B7-H3(CD276)和B7x(B7 H4或B7S1)。
1999年,Dong等从胎盘环状脱氧核糖核酸(circular deoxyribonucleic acid,cDNA)库中克隆到B7-H1基因。Hori等人在实验中发现,B7-H1mRNA在正常小鼠的角膜内皮细胞、深层的基质细胞及虹膜睫状体均有高度表达,而在角膜上皮及视网膜表面未见明显表达。PD-1在正常小鼠的角膜及虹膜睫状体表面均未见表达。但在移植术后的角膜移植片内皮及虹膜睫状体中,B7-H1及PD-1均有高度表达。Hod等人在实验中通过给受体小鼠腹腔注射抗体封闭B7-H1及PD-1,发现抗体封闭后的小鼠角膜植片存活时间比对照组明显缩短,且植片100％出现排斥,提示B7-H1及PD-1在角膜移植免疫赦免中发挥了重要作用。
因此,研究角膜移植术后免疫赦免,对于进一步了解角膜移植术后免疫排斥反应的发生及可能机制有重要意义。本研究主要目的:研究B7-H1分子在角膜移植免疫赦免中的作用。包括以下主要内容:
1.建立同种异体小鼠角膜移植动物模型,观察术后排斥反应情况,了解移植术后小鼠角膜存活与排斥的情况。
2.采用免疫组化化学方法检测共刺激分子B7-H1在正常小鼠眼球组织及移植术后存活或排斥小鼠眼球组织中的表达情况,qPCR检测B7-H1mRNA在三组小鼠角膜组织的表达情况,探讨B7-H1在同种异体小鼠角膜移植术后免疫赦免中的作用。
材料和方法
1.实验动物:实验小鼠均为清洁小鼠(SPF级),供体:C57BL/6:受体:BALB/c小鼠,8—10wk龄,雌性,18—22g。建立同种异体小鼠角膜移植动物模型,术后观察排斥反应指数(RI)的动态变化,于术后8周取材。
2.病理切片及免疫组织化学检测将3组(正常、排斥、存活)小鼠眼球摘除,经10％福尔马林固定,常规石蜡包埋后连续切片,部分切片以苏木素及尹红染色,酒精脱水,中性树胶封片,显微镜下观察组织细胞学改变:以3um厚切片行B7-H1免疫组织化学染色,采用SP二步法,微波修复抗原,DAB显色,显微镜下观察。分别将已知的阳性片设为阳性对照。所有的标本均以PBS代替一抗作为阴性对照。细胞质或细胞核呈棕黄色至深棕黄色为阳性染色细胞。
3.Quantitative Real—time PCR(qPCR)检测使用试剂盒为(Roche High Pure RNA Tissue Kit)-Cat.No.12033674001提高纯度RNA,使用Takara公司的PrimeScript(R)RT reagent Kit试剂盒(货号DRR037A)逆转录提取样品DNA。标本先在液氮中研碎,其他操作按说明书进行。提取的DNA样品直接用于qPCR实验。用以下引物为:
B7-H1
上游5‘-ACAGCAACTTCAGGGGGAGAGC3’
下游5‘-CGGGTTGGTGGTCACTGTTTGT-3’
b-actin上游5‘-CTGGCTGGCCGGGACCTGAC-3’
下游5‘-ACCGCTCGTTGCCAATAGTGATGA-3’
qPCR反应体系如下:2X混合Bufferloul、模板2ul、引物各0.4ul、水7.2ul,反应总体积共20ul。反应条件:94℃100s(94℃0s,55℃0s,72℃5s)X50个循环72℃60s。溶解曲线条件:60℃-98℃每隔秒0.2℃,每秒采集信号1次。
4.统计学分析
采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,数据用((X)±s)表示。采用方差分析方法对各组(正常组、存活组及排斥组)角膜移植片中B7-H1 mRNA的差异进行比较。采用LSD法进行各组间两两比较。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1.小鼠原位角膜移植存活率为100％,同种异体小鼠角膜移植存活率为25％。
2.各组(正常组、存活组及排斥组)取眼球组织行免疫组化检测结果免疫组化结果显示,B7-H1分子主要集中在角膜深层基质及内皮层,可见明显的细胞核染色,上皮层未见明显表达。
正常小鼠角膜及虹膜睫状体组织高度表达B7-H1分子,移植术后存活小鼠角膜及虹膜睫状体组织也高度表达B7-H1分子,而移植术后排斥的小鼠角膜及虹膜睫状体组织几乎未见B7-H1分子表达。
3.各组(正常组、存活组及排斥组)取角膜移植片行qPCR检测结果B7-H1 mRNA在正常小鼠角膜组织中高度表达。将正常C57BL/6小鼠角膜移植到BALB/c小鼠眼球上,B7-H1mRNA在存活的角膜移植片中高度表达,而在发生排斥的角膜移植片中表达不明显,三组间差异有统计学意义(P<0.001)。
结论
1.同种异体小鼠角膜移植术后排斥率75％,说明移植术后排斥反应仍是角膜移植失败的最主要因为；25％的存活率提示,免疫排斥在小鼠角膜移植中并非绝对,免疫赦免在小鼠角膜移植中发挥了重要作用。
2.共刺激分子B7-H1在正常小鼠及移植术后存活的小鼠角膜、虹膜睫状体均见高度表达,而在移植术后发生排斥的小鼠角膜及虹膜睫状体组织均未见明显表达,说明B7-H1分子参与了同种异体小鼠角膜移植术后的免疫赦免反应,是维持眼角膜免疫赦免状态的重要因子之一。