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目的:构建大鼠髓样细胞表达激发受体—1/人IgG融合蛋白真核表达载体,在家蚕Bm细胞中实现稳定表达,并且观察融合蛋白TREM—1/IgG对急性重症胰腺炎大鼠的疗效。
方法:分别设计引物PCR扩增大鼠TREM—1胞外区和人IgGFc段,产物酶切回收片段用T连接酶连接后PCR扩增,扩增产物克隆至pMD18—T质粒中,并与转座载体Bac1分别用BamHⅠ,HindⅢ双酶切,回收两端带酶切位点的基因片段,用T连接酶连接,构建重组转座质粒,并转化感受态DH5a,接种于含氨苄青霉素的营养琼脂上,37℃培养12 h,挑取单菌落,提取质粒进行酶切鉴定,测序。将重组转座质粒转入感受态大肠杆菌DH10Bac中,涂于含X—ga1和IPTG的筛选平板(含庆大霉素、卡那霉素及四环素)上,37℃培养48h,挑取白色菌落以及蓝色阴性对照菌落,提取重组杆粒,并用pUC/M13引物做PCR鉴定正确,并转染Bm细胞,蛋白表达,Western—blot法行蛋白鉴定并纯化蛋白。
雄性SD大鼠40只,随机分为融合蛋白治疗1组、融合蛋白治疗2组、生理盐水组、对照组各10只。前三组采用精氨酸腹腔注射构建急性重症胰腺炎大鼠模型,造模成功后2小时,融合蛋白治疗1组大鼠予以尾静脉注射纯化后的融合蛋白TREM—1/IgG,给药浓度为4mg/kg,治疗后24小时处死大鼠;融合蛋白治疗2组大鼠于造模成功后12小时尾静脉注射纯化后的融合蛋白TREM—1/IgG,治疗后24小时处死大鼠;生理盐水组予以生理盐水注射,治疗后24小时处死大鼠;对照组无处理。各组检测血淀粉酶、谷丙转氨酶及C反应蛋白水平,观察各组大鼠胰腺组织病理学变化,并对组织损伤评分。
结果:RT—PCR扩增出大鼠TREM—1胞外区和人IgG重链基因Fc恒定区,上述PCR产物连接扩增后与载体pMD—18 T连接后转化大肠杆菌,抽提质粒用BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定正确,再与转座载体Bac1连接,转染后获得重组质粒。测序结果证实序列、启动子、终止子位置及读码框完全正确。重组质粒转入感受态大肠杆菌DH10Bac中,获得重组杆粒,用pUC/M13引物做PCR鉴定正确。重组杆粒稳定转染Bm细胞,收获总蛋白,利用Protein A与目的蛋白IgG FC段特异性结合的性质,免疫亲和纯化,快速获取目的蛋白粗品。SDS—PAGE可见39KD左右的目的蛋白条带。Western Blot结果证明该蛋白样品可被抗REM—1抗体特异性识别,证明该蛋白为TREM—1融合蛋自。
融合蛋白治疗1组大鼠予以TREM—1/IgG融合蛋白治疗24小时后,与融合蛋白治疗2组和生理盐水组大鼠相比,血淀粉酶、谷丙转氨酶及C反应蛋白水平有下降趋势。融合蛋白治疗1组大鼠的胰腺炎症、出血、坏死的评分,较其它两组,得到显著改善(P<0.05、)。
结论:成功构建了TREM—1/IgG融合蛋白真核表达载体,并在Bm细胞中稳定表达。融合蛋白TREM—1/IgG能有效缓解急性重症胰腺炎大鼠的炎症反应,减轻胰腺损害,且主要是在重症胰腺炎发病早期发挥重要作用,有效抑制炎性反应的触发及放大过程,在大鼠体内验证了TREM—1做为急性重症胰腺炎分子治疗靶点的价值。