结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是结肠及直肠发生的恶性肿瘤,是最常见的恶性肿瘤之一^[1-5]。近年来,随着工业化的进程,生活环境恶化,饮食结构不合理,生活节奏加快,人口结构变化等,CRC的发病率逐步增高,严重威胁人类健康,美国最新癌症流行病学统计数据显示CRC的发病率在各类恶性肿瘤的发病率中位于第三位^[6-14]。在中国CRC的新发病率和死亡率有上升趋势。据2015年中国癌症统计数据显示,在全部恶性肿瘤中结直肠癌发病率、死亡率均位居第5位,新发病例有37.6万,死亡病例有19.1万。经济发达城市地区发病率远高于农村,结直肠癌发病率上升显著^[15-21]。当前,结直肠癌是以外科手术治疗为主,结合化疗,放疗,靶向药物治疗等综合治疗,但总的5年生存率约50%^[22-30]。因此,进一步研究结肠癌的肿瘤特异性标志物,为临床结肠癌的诊治提供新靶点及手段,具有重要意义。本研究首先运用生物信息学,分析了癌症基因组图谱（The Cancer Genome Altas,TCGA）中的结肠癌测序数据^[31-33],挖掘了在正常结肠组织和结肠癌组织中差异表达基因,深入分析了差异基因参与的生物学过程。在差异基因中发现了GSPT1（G1 to S phase transition 1）在结肠癌发生发展的生物学过程中发挥重要作用。基于UCSC基因组浏览器分析发现,GSPT1位于人类16号染色体长臂13区（chr16 p13.13）,在蛋白质编码区有10个外显子组成,其转录时通过可变剪切形成2个不同的转录本,翻译编码508个氨基酸。定量PCR和免疫组织化学染色发现,GSPT1在结肠癌组织中异常高表达。据此推测,GSPT1结肠癌的发生、进展及转归中某些生物学过程中发挥重要作用。查阅国内外文献发现,GSPT1在结肠癌中的的生物学功能及分子机制尚未报道。本论文以GSPT1为核心,利用细胞生物学、病理学和分子生物学技术明确GSPT1在结肠癌中的生物学功能,并采用高通量IP-MS分析寻找GSPT1调控的靶基因及参与的分子信号通路,阐述GSPT1在结肠癌中可能的分子生物学机制。第一部分基于生物信息学分析GSPT1可作为结肠癌的生物标志物及临床意义目的:利用生物信息学分析TCGA数据库中的结肠癌测序数据,预测并验证在结肠癌发生发展中的关键基因。方法:用TCGA-Assembler下载、处理结肠癌测序数据,以差异倍数>2,Q值<0.05筛选标准,分析在结肠癌患者中显著差异表达的基因,随后对差异基因进行基因本体（Gene Ontology,GO）和KEGG Pathway富集分析,Cytoscape软件展示差异基因间共表达互作关系。应用qRT-PCR、western blot及免疫组化技术检测GSPT1在结肠癌组织和正常结肠组织中的表达,结合临床资料统计学分析GSPT1与结肠癌患者的分期、分级及肿瘤大小等临床特点之间的关系。结果:生物信息学分析,结肠癌组织中共发现1000个显著差异表达的基因,其中353个显著上调基因647个显著下调的基因,GO和Pathway的功能富集分析发现差异基因主要参与了细胞增殖（cell proliferation）、细胞周期（cell cycle）、细胞分裂（cell division）、细胞分子代谢过程（cell molecule metabolic process）、Focal adhesion（细胞粘附）、Metabolic pathways（代谢通路）、MAPK信号通路（MAPKsignaling pathway）等生物学过程及信号通路。结果提示GSPT1可能在结肠癌的发生发展中发挥重要作用。定量PCR和免疫组织化学染色分析发现,GSPT1在结肠癌患者中异常高表达,具有统计学差异（P<0.05）。结论:基于生物信息学发现了GSPT1在结肠癌中异常表达及在组织样本中定量PCR和免疫组织化学染色分析验证,GSPT1是潜在的临床诊断标志物。第二部分GSPT1在结肠癌细胞中的生物学功能研究目的:以结肠癌细胞株HCT116和SW480为研究模型,探讨GSPT1对结肠癌细胞的细胞增殖、细胞周期、凋亡及侵袭能力的影响。通过裸鼠体内皮下成瘤实验,检测GSPT1对结肠癌细胞体内成瘤能力的影响。方法:运用siRNA干扰技术合成靶向GSPT1的小干扰RNA,在结肠癌细胞株中干扰GSPT1的表达,定量PCR和western blot检测siRNA的沉默效率,Cell Counting Kit-8（CCK8）、EdU、平板克隆形成、流式细胞仪和transwell分别检测结肠癌细胞中沉默GSPT1后增殖、细胞周期、凋亡、侵袭能力的变化。合成靶向GSPT1的shRNA的慢病毒,感染HCT116后嘌呤霉素筛选稳定低表达细胞株,荧光定量PCR和western blot鉴定低表达细胞株。构建人源GSPT1真核过表达载体,转染HCT116细胞后,探讨过表达GSPT1对结肠癌细胞周期、凋亡和克隆形成的影响。裸鼠体内皮下成瘤实验,检测稳定低表达GSPT1后对结肠癌细胞成瘤能力的影响。结果:定量PCR和western blot结果显示,合成的siRNA转染HCT116和SW480后能有效沉默GSPT1的表达。GSPT1被沉默24小时后HCT116和SW480的增殖能力开始受到抑制,随着干扰时间的增加,结肠癌细胞的增殖能力的抑制逐渐明显,呈时间梯度的依赖。流式细胞仪检测凋亡结果发现,沉默GSPT1后可以诱发结肠癌细胞凋亡发生。流式细胞周期检测和EdU实验结果发现,沉默GSPT1后抑制了结肠癌细胞DNA的合成,阻滞细胞周期G1到S期的转换的正常进程。裸鼠体内皮下成瘤结果显示稳定低表达GSPT1的结肠癌细胞肿瘤生长受到抑制;定量PCR和western blot表明在HCT116中成功过表达了GSPT1,过表达GSPT1后促进了结肠癌细胞的增殖和周期进展,抑制了凋亡的发生。结论:在结肠癌细胞中GSPT1促进了细胞增殖和周期,抑制细胞凋亡,其在结肠癌的发生发展中起着重要作用。第三部分GSPT1调控结肠癌细胞周期的分子机制研究目的:探讨GSPT1调控结肠癌细胞生物学功能相互作用的靶基因和参与的信号通路。方法:运用GSPT1的IP级抗体,在HCT116结肠癌细胞中进行免疫沉淀（IP）,和IP-normal IgG组比IP-GSPT1组的特异性条带进行质谱分析处理,分析GSPT1相互作用的蛋白,并应用Western blot检测GSPT1参与的GSK3β的下游信号通路。结果:发现和IP-normal IgG组比IP-GSPT1组有特异性条带,质谱分析结果发现GSPT1和泛素化连接酶TRIM4直接结合,导致GSK-3β蛋白的泛素化降解。Western blot结果发现,沉默GSPT1后GSK-3β、P21、P27表达升高,周期相关蛋白CyclinD1、CDK4、CDK6、CyclinE和CDK2的表达下降。结论:在结肠癌中GSPT1和泛素化连接酶TRIM4相互作用,负向调节GSK-3β信号通路,GSPT1促进结肠癌细胞周期、增殖。