论文部分内容阅读
目的：肿瘤微环境对于肿瘤细胞特别是肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSCs)的调控,在肿瘤的进展、转移和治疗中发挥重要作用,因此探讨肿瘤微环境对CSCs的调控作用及机制,对于改善肿瘤患者预后具有重要意义。肿瘤微环境中的CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cells, Tregs),被认为是肿瘤免疫抑制的主要机制之一,但其对CSCs的影响目前尚未见报道。本研究主要探讨rregs对于乳腺癌CSCs数量及功能的影响；在此基础上验证TGF-β1诱导的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是否是Tregs调控CSCs的主要机制。方法：1.收集天津医科大学肿瘤医院浸润性乳腺癌根治术后石蜡组织标本104例,应用免疫组织化学法检测标本中Foxp3阳性Tregs和ALDH1阳性细胞的数量,分析其与乳腺癌临床病理特征之间的联系以及两者之间的相关性。2.免疫磁珠法分离乳腺癌患者外周血中CD4+CD25+Tregs,与乳腺癌细胞株MCF-7和BT474共孵育。从基因和蛋白水平检测了MCF-7及BT474细胞与Tregs共孵育前后肿瘤细胞EMT相关标志物及转录因子分子表达水平的变化。并用细胞划痕实验和transwell侵袭实验评价了细胞迁移和侵袭能力的变化。应用流式细胞术、]eal-time PCR和western blot分别检测了BT474细胞中ALDEFLUOR+细胞比例以及ALDH1基因和蛋白表达的改变。利用体外乳腺癌CSCs微球培养实验和微球连续传代实验检测了Tregs对BT474细胞中CSCs样细胞数量和自我更新能力的影响。并利用5周龄雌性BALB/c裸鼠建立异种移植瘤模型,评价Tregs对乳腺癌细胞体内成瘤能力的影响。3.利用TGF-β1中和抗体、TGF-β1受体小分子阻滞剂SB431542阻断TGF-β1通道评价TGF-β1在Tregs调控乳腺癌细胞EMT和干性特征中的作用。建立肿瘤细胞与Tregs的隔离培养体系和肿瘤细胞与Tregs上清共培养体系来探讨Tregs发挥作用的方式。结果：1.38.5%的乳腺癌标本可见ALDH1蛋白的表达,在低分化肿瘤(P=0.019)、雌激素受体阴性(P=0.028)、孕激素受体阴性(P=0.046)及三阴性(P=0.008)乳腺癌患者中含有较多的ALDH1+细胞。Foxp3+Tregs在分化程度较低(P=0.001)和有淋巴结转移患者(P=0.025)中数量较多。Foxp3+Tregs和ALDH1+CSCs样细胞之间存在正相关性(r=0.215,P=0.029)。2.与Tregs共孵育后BT474细胞间质性标志物N-cadherin和vimentin表达增高；MCF-7细胞上皮性标志物E-cadherin表达降低,间质性标志物N-cadherin和fibronectin表达增高。共孵育后EMT相关转录因子Slug的表达以及细胞迁移和侵袭能力在两组肿瘤细胞中都明显上调。相比对照组,共孵育组BT474细胞中ALDEFLUOR+CSCs样细胞比例,体外微球形成能力、自我更新能力以及小鼠体内致瘤能力增强。3.阻断TGF-β通路可以阻断Tregs诱导的乳腺癌细胞EMT和干性增加。共孵育组上清中TGF-β1浓度稍高于对照组(P=0.047)。免疫荧光显示Tregs表面可见TGF-β1表达。BT474细胞中ALDEFLUOR+细胞比例在对照组、共孵育组、隔离培养组和Tregs上清培养组分别为45.2%、73.4%、50.1%和50.6%。结论：1.人乳腺癌组织中存在Foxp3+Tregs与ALDH1+CSCs样细胞,两者之间存在正相关性。2. CD4+CD25+Tregs可以诱导乳腺癌细胞发生EMT,并增强细胞体外迁移和侵袭能力,同时提高乳腺癌细胞干性特征。3. CD4+CD25+Tregs通过TGF-β途径促进乳腺癌细胞EMT和干性增加,并且主要通过其表面膜结合型TGF-β1以直接接触的方式发挥作用。