鸟氨酸脱羧酶抗酶(ornithine decarboxylase antizyme，OAZ)，最初作为鸟氨酸脱羧酶（ornithine decarboxylase，ODC，多胺生物合成途径的限速酶）的负调控子而被熟知，实体瘤中异位表达外源OAZ，可减缓肿瘤细胞恶性增殖、引起细胞周期停滞，体现其抗肿瘤能力及作为肿瘤治疗潜在靶点的重要价值。目前对于OAZ作用机制的认识主要从以下三个方面出发:OAZ蛋白的表达具有一个独特的frameshift机制，即在mRNA的翻译过程中，若核糖体移至ORF1的终止密码子处(TCCTGATG)受多胺调控，则发生+1位移码延续翻译出具有完整抗酶活性的OAZ1蛋白。为此，我们可在框移位点处设置一个位点的突变(TCCTGATG→TCCGATG)，以排除实验过程中外源物质对实验结果的干扰作用;OAZ作为体内多胺平衡调控中的枢纽，通过与多胺生物合成限速酶ODC高亲和性结合，并靶向促使26S蛋白酶体降解ODC亚基，同时还可能改变细胞膜上的多胺转运载体，减少细胞对外源多胺的摄取并促进其排出，实现对多胺体内平衡的调节;最后，OAZ结合ODC后促使ODC进行非泛素依赖的蛋白酶降解作用也发生在一些细胞增殖的正调控因素，如cyclinD1、Smad1、Aurora-A kinase，提示该机制可能是OAZ在细胞中发挥调节作用的重要机制。　　 慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia，CML)源于造血干细胞的恶性增殖克隆性疾病，以9号、12号染色体区域相互异位为特征t(9;22)(q34;q11)，产生增强型的BCR/ABL酪氨酸癌基因。BCR/ABL酪氨酸癌基因表达的融合蛋白具有明显增高的酪氨酸激酶活性，自发通过多条途径进行信号转导，干扰了正常的细胞程序，与后期细胞分化的抑制和对细胞凋亡的耐受直接相关，是CML疾病发生重要原因。随着肿瘤发病学的深入研究，诱导分化疗法成为肿瘤治疗学的新思路。对人急性髓性白血病和骨髓增生异常综合征的诱导分化治疗上已获得确切疗效并进入临床研究阶段，而目前对慢性髓性白血病进行诱导分化治疗的研究还处于起步阶段。K562细胞是体外研究白血病恶性表达调控的良好模型，可被多种诱导剂诱导向良性方向分化，研究证实氯化高铁血红素(Hemin)对其具有特异的红系诱导分化作用。应用马文丽等创建的RD-PCR技术筛选Hemin诱导前后细胞间差异表达cDNA片段，提示OAZ1与K562分化存在相关性，但其确切功能及机制还有待于进一步研究证实。此外，本实验过程中亦发现OAZ1对K562细胞具有潜在的诱导凋亡作用。因此，本课题旨在明确OAZ1对慢粒白血病K562细胞红系分化、凋亡的作用及分子机制，为以OAZ1为靶点的CML治疗提供理论依据。　　 研究方法:构建框移位点突变的OAZ1过表达慢病毒载体pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen（OAZ1为人工合成目的片段687bp，合成时在框移位点处直接设置一个位点的缺失突变TCCTGATG→TCCGATG），包装病毒并感染K562细胞，G418药物或流试细胞分选构建K562/OAZ1、K562/GFP稳转株，采用Real-time RT-PCR和Western blot技术验证OAZ1过表达效果。收集各组细胞（实验组K562/OAZ1、空对照组K562/GFP和未处理组K562），FACS检测K562细胞早期红系表面标志抗原CD71和中晚期红系标志物血型糖蛋白A(glycophorin，GPA)，结合联苯胺染色分析OAZ1过表达对K562细胞红系分化的作用。与此同时，我们对比Hemin诱导组，检测与K562细胞红系分化、癌变的关键基因(GATA1、BCR/ABL、TGFβ)转录水平，对OAZ1诱导分化机制进行初步探索。实验中，发现K562/OAZ1组细胞荧光强度远不如K562/GFP组，且传代过程中荧光率丢失快，考虑与OAZ1抑制细胞增殖及凋亡作用相关，为此通过AnnexinV-PE/7-AAD双染法分析OAZ1过表达对K562细胞凋亡的作用。此外，取43例CML患者和23例健康对照外周血淋巴细胞的总RNA，利用Real-time RT-PCR技术检测了OAZ1的mRNA水平，进一步验证先前体外细胞实验结论。为了深入了解OAZ1对慢粒白血病K562细胞红系分化、凋亡的分子机制，人源白血病PCR芯片被用于检测参与此分化及凋亡过程的关键基因表达差异，该芯片上含有被证实的普遍参与白血病发生与发展进程的84个关键基因，能够方便且准确的分析所关注基因的表达情况。监测OAZ1过表达后，K562细胞中这些基因的表达情况可进一步了解OAZ1对白血病作用的分子机制。根据芯片结果的数据分析，我们选择了4个感兴趣的差异表达基因，通过Real-time RT-PCR技术进一步对芯片结果进行验证，并讨论了OAZ1对这些差异基因表达调控的可能机制。　　 研究结果:慢病毒过表达载体pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen经双酶切、测序鉴定构建成功，Real-time RT-PCR及Western blot技术验证感染后细胞内OAZ1转录及翻译水平升高。OAZ1蛋白过表达后，FACS分析K562细胞分化标志物CD71+/GPA+双阳性率为(11.22±2.09)％，与未处理组(4.07±1.04)％、空对照组（1.79±2.36）％相比差异有统计学意义（P＜0.01）;联苯胺蓝染阳性率为(14.037±0.083)％，与另外两组对照比较差异也有统计学意义(P＜0.01)。对红系分化指标的测定结果表明OAZ1可诱导慢粒白血病K562细胞向成熟红系方向分化，初步探索诱导分化机制提示相对于GATA1、BCR/ABL mRNA转录水平的影响，OAZ1对TGFβ基因的作用更为明显。利用Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒检测K562/OAZ1细胞凋亡率为(23.54±2.23％;p＜0.01)，与K562(8.21±2.18％)和K562/GFP(15.91±2.23％)相比差异有统计学意义，提示OAZ1可诱导慢粒白血病K562细胞凋亡的发生。CML患者群中OAZ1、TGFβ均显著下调表达，与体外细胞实验结果相符，体内实验验证了OAZ1的抗肿瘤潜力及其与TGFβ基因表达的相关性。人源白血病PCR芯片筛选OAZ1过表达后差异表达基因，其中有19个基因表达发生变化（两倍以上的差异变化），10个上调、9个下调。尽管这些基因的改变并非都是有利于细胞恶性的改善，但在K562细胞中OAZ1过表达所引起的基因差异改变最终诱导其走向有意义的细胞红系分化及凋亡。根据芯片结果，我们选择了4个有益的感兴趣差异基因，通过定量PCR进行验证，结果表明除了CDH13外，CXCL10、DAPK1和IKZF3这三个基因均与芯片结果相符，表达显著上调。　　 TGFβ（transforming growth factor beta，转化生长因子β）可诱导K562细胞血红蛋白的聚集，与其他因子协同细胞分化作用，研究证实TGFβ/Smads信号转导系统在造血过程中起抑制细胞生长作用，TGFβ的高表达有效控制白血病细胞的恶性增殖及分化进程。CXCL10（chemokine C-X-C motif ligand10，CXC亚家族的趋化因子成员之一），通过结合CXCR3受体后起多效作用，包括趋药性、凋亡、增殖和抑制肿瘤血管生成等作用。DAPK1(death-associated protein kinase1，死亡相关蛋白激酶)，在CML中该基因的CpG岛处发生异常甲基化现象。IKZF3(IKAROS familyzinc finger3，Ikaros锌指蛋白家族成员之一)，作为转录因子参与B淋巴细胞增殖和分化。OAZ1通过直接或间接作用这些基因的表达水平改变，可能打破细胞内的病态平衡，恢复正常造血功能，从而诱导白血病细胞向成熟红系方向分化和凋亡作用的发生，然而其调控这些基因变化的机制有待于进一步证明。　　 多胺是生物体内普遍存在的有机多功能阳离子（包括亚精胺、精胺及腐胺），可与细胞中的DNA、RNA及磷脂等带负电的生物大分子结合。多胺缺失可导致生长抑制，而过盛则有致癌作用或造成细胞毒性反应，因而细胞内多胺水平的调节具有重大意义。Yamamoto D等的研究表明，在舌鳞癌细胞UM1中 OAZ基因的异位表达可诱导基因组DNA上CpG岛的低甲基化，可能使一些肿瘤抑制基因、生长及分化相关基因重新获得表达。我们知道，细胞内多胺的合成与甲基化反应中存在着代谢通路的偶联，dcSAM是多胺合成过程中氨丙基的供体，但同时又是甲基化反应中SAM的竞争性抑制剂。OAZ蛋白高表达抑制ODC蛋白功能，其催化鸟氨酸向腐胺转变的反应减弱，腐胺进一步转变为亚精胺、精胺过程的减弱将导致dcSAM的积累，其可作为甲基化反应中SAM的竞争降抑制剂，进而引起基因组DNA上随机总体上的低甲基化状态。我们的结果揭示一些基因表达（甚至更多）可直接或间接被OAZ1上调，是否是由于OAZ1对多胺及基因组甲基化状态的调制作用呢？　　 结论:(1) OAZ1基因可诱导慢粒白血病K562细胞向成熟红系方向分化;(2) OAZ1过表达后慢粒白血病K562细胞凋亡率增加，OAZ1可能参与细胞内凋亡途径的诱导;(3)慢粒白血病患者群内OAZ1的转录水平显著下调，验证了OAZ1潜在的抗肿瘤能力;(4) OAZ1在慢粒白血病K562细胞中的过表达可引起细胞内大量基因表达的改变，其中我们验证了TGFβ、CXCL10、DAPK1和IKZF3这几个所关注基因的差异变化。