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背景:尿酸(UA)是嘌呤代谢产物。人类在进化的过程当中,由于尿酸酶的基因发生变异,致使其功能失活,使得人血UA浓度显著高于其它哺乳类动物。近年来,大量的临床调查及循证实践证实高尿酸血症(HUA)是心脑血管系统疾病独立的危险因子。血管钙化(VC)可导致血管脆性及僵硬度增加,增添了动脉斑块、血管破裂及动脉瘤形成的危险性,是导致心肌梗塞、中风等心脑血管事件的重要危险因子。高尿酸是否通过诱导血管钙化参与动脉硬化的发生和发展,从而诱发各种心血管疾病值得探讨。血管钙化与血管壁细胞,尤其是血管的平滑肌细胞在各类刺激因素作用下活化,转化成为成骨样细胞密切相关。大量研究证实UA可以诱导血管平滑肌细胞(VSMC)增殖及氧化应激。高尿酸是否通过诱导VSMC分化成为成骨样细胞,从而导致VC目前尚不清楚,对其进行深入研究,势在必行。前期工作中,课题组在国际上首次在动物模型中发现高尿酸血症导致以早期出现弥漫性血管钙化为特征的动脉硬化的直接证据。基于该发现,本课题拟对高尿酸血症导致动脉硬化的机制进行研究。第一部分尿酸诱导大鼠原代平滑肌细胞向成骨样细胞分化目的:探讨尿酸是否可以在一般培养环境中刺激血管平滑肌细胞向成骨样细胞转化。方法:分离、培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,免疫组织化学方法检测α-平滑肌肌动蛋白鉴定VSMC。(1)含不同浓度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)的培养基培养血管平滑肌细胞24h,48h和72h后,CCK-8法检测UA对VSMC增殖的影响。(2)含不同浓度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)的培养基培养血管平滑肌细胞,分别作用3天,7天,14天,每3天换液一次。采用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒微量酶标法测定培养液中的ALP活性,并通过细胞蛋白定量计算相应的ALP活性值。(3)将大鼠胸主动脉平滑肌细胞接种于24孔板,在含不同浓度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)培养基中连续培养14天,用茜素红矿化结节染色。(4)将大鼠VSMC接种于6孔板,在含不同浓度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)培养基中连续培养14天。提取细胞总RNA,Real-Time PCR(RT-PCR)检测成骨细胞骨样标志物Runx2、BMP-2、OPN m RNA水平变化及平滑肌表型标志物SM22αm RNA水平变化。(5)将大鼠VSMC接种于6孔板,在含不同浓度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)培养基中连续培养14天。提取细胞总蛋白,蛋白质免疫印迹(WB)法检测细胞Runx2蛋白表达。结果:(1)血管平滑肌细胞在尿酸浓度200μmol/L及400μmol/L作用下,细胞增殖,且呈浓度与时间依赖性。尿酸浓度在800μmol/L时,其增殖作用相比400μmol/L有减弱趋势。(2)尿酸浓度为800μmol/L时,在作用7天和14天时ALP活性明显增强,且随着时间增加,其增加效果越明显。但UA200μmol/L和400μmol/L,ALP活性随作用时间增加趋势不明显。(3)茜素红染色未见显著矿化结节出现。(4)成骨样标志物Runx2,BMP-2,OPN的m RNA水平在尿酸浓度800μmol/L明显增高。平滑肌表型标志物SM22α各组见未有明显差异。(5)尿酸800μmol/L时,Runx2蛋白表达明显增高,其他浓度Runx2表达增高不明显。结论:尿酸可诱导VSMC增殖,高浓度尿酸可诱导成骨样细胞标志物Runx2,BMP-2,OPN的m RNA表达,提示尿酸有诱导大鼠原代胸主动脉VSMC向成骨样细胞分化的趋势。第二部分尿酸促进大鼠原代胸主动脉平滑肌细胞向成骨样细胞分化及矿化目的:探讨在成骨诱导剂存在的前提下,尿酸促进VSMC成骨样分化及矿化的能力。方法:(1)含不同浓度尿酸(0,200,400和800μmol/L)+成骨诱导剂的培养基培养血管平滑肌细胞24h,48h和72h后,CCK-8检测尿酸对VSMC增殖的影响。(2)尿酸浓度0μmol/L+成骨诱导剂,200μmol/L+成骨诱导剂,400μmol/L+成骨诱导剂,800μmol/L+成骨诱导剂,作用14天,ALP试剂盒检测相应的ALP活性。(3)将大鼠VSMC接种于24孔板,在含不同浓度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨诱导剂培养基中连续培养14天,用Von Kossa染色试剂盒进行钙盐沉积染色。(4)将大鼠VSMC接种于24孔板,在含不同浓度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨诱导剂培养基中连续培养14天,用茜素红进行矿化结节染色并进行定量钙盐分析。(5)将大鼠VSMC接种于6孔板,在含不同浓度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨诱导剂培养基中连续培养14天。提取细胞总RNA,Real-Time PCR检测检测成骨细胞骨样标志物Runx2、BMP-2、OPNm RNA水平变化及平滑肌表型标志物SM22αm RNA水平变化。(6)将大鼠VSMC接种于6孔板,在含不同浓度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨诱导剂培养基中连续培养14天。提取细胞总蛋白,Western Blotting方法检测细胞Runx2蛋白表达。结果:(1)VSMC在尿酸浓度200μmol/L、400μmol/L、800μmol/L联合成骨诱导剂作用下,细胞增殖,且呈浓度与时间依赖性。(2)尿酸作用于VSMC后ALP活性在尿酸浓度为400μmol/L、800μmol/L时明显增高,且呈浓度依赖性增长。(3)Von Kossa染色结果显示,各组均有钙盐沉积,肉眼可见有尿酸(200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨诱导剂组较对照组颜色稍深。(4)茜素红染色各组均有染色阳性的橘黄色沉淀,肉眼观察UA800μmol/L+成骨诱导剂组染色最明显。定量分析结果可见钙盐沉积呈尿酸浓度依赖性增长。(5)成骨样细胞标志物Runx2,BMP-2,OPN的m RNA表达在尿酸浓度400μmol/L+成骨诱导剂,800μmol/L+成骨诱导剂明显增高,且呈浓度依赖性。平滑肌表型标志物SM22α在800μmol/L+成骨诱导剂组较对照组明显减少。(6)尿酸400μmol/L+成骨诱导剂组,800μmol/L+成骨诱导剂组,Runx2蛋白表达较对照组明显增高,且呈浓度依赖性。结论:在成骨诱导剂存在时,高浓度尿酸可明显促进大鼠胸主动脉平滑肌细胞向成骨样细胞分化及矿化。第三部分尿酸通过激活Wnt/β-catenin通路促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化目的:探讨尿酸促进大鼠VSMC细胞向成骨样细胞分化的机制。方法:(1)VSMC在不同浓度尿酸(0μmol/L,200μmol/L,400μmol/L,800μmol/L)+成骨诱导剂培养基中培养24h,48h后,进行ROS荧光探针-DHE染色及DAPI核染色。(2)实验分组UA0μmol/L+成骨诱导剂,UA200μmol/L+成骨诱导剂,UA400μmol/L+成骨诱导剂,UA800μmol/L+成骨诱导剂,UA800μmol/L+成骨诱导剂+Dkk-1,UA800μmol/L+成骨诱导剂+CHIR98014。连续培养14天,测相应的ALP活性。(3)将大鼠VSMC接种于6孔板。分组:UA0μmol/L+成骨诱导剂,UA200μmol/L+成骨诱导剂,UA400μmol/L+成骨诱导剂,UA800μmol/L+成骨诱导剂,UA800μmol/L+成骨诱导剂+Dkk-1,UA800μmol/L+成骨诱导剂+CHIR98014,连续培养14天。提取细胞总RNA,Real-Time PCR检测成骨细胞骨样标志物m RNA水平变化。(4)将大鼠VSMC接种于6孔板。分组:UA0μmol/L+成骨诱导剂,UA200μmol/L+成骨诱导剂,UA400μmol/L+成骨诱导剂,UA800μmol/L+成骨诱导剂,UA800μmol/L+成骨诱导剂+Dkk-1,UA800μmol/L+成骨诱导剂+CHIR98014,连续培养14天。提取细胞总蛋白,Western Blotting法检测细胞β-catenin,Runx2蛋白表达。结果:(1)DHE染色结果显示,随着尿酸浓度增加,VSMC内红色荧光亮度逐渐增强,提示尿酸可诱导大鼠胸主动脉平滑肌细胞ROS生成,且其促进作用呈浓度依赖性。尿酸作用24h,48h,DHE染色随时间同样浓度有加深,呈时间依赖性。(2)尿酸800μmol/L加入Wnt/β-catenin通路抑制剂Dkk-1后,ALP活性明显降低,尿酸800μmol/L加入Wnt/β-catenin通路激活剂CHIR后,ALP活性略有升高。(3)尿酸800μmol/L+成骨诱导剂在加入Wnt/β-catenin通路抑制剂Dkk-1后,Runx2、BMP-2、OPN的m RNA表达较单纯尿酸800μmol/L+成骨诱导剂组均明显降低。(4)尿酸800μmol/L+成骨诱导剂+Dkk1组抑制了平滑肌细胞β-catenin,Runx2蛋白表达,而尿酸800μmol/L+成骨诱导剂+CHIR组促进了平滑肌细胞β-catenin,Runx2蛋白表达。结论:尿酸部分通过激活Wnt/β-catenin通路促进血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化。