研究背景及目的哺乳动物的心脏在压力负荷增加的情况下会发生心肌肥厚,以适应增加的工作负荷,持续的心肌肥厚会导致心脏功能失代偿,随后发生心衰。心肌肥厚的主要病理表现有心肌细胞肥大、心肌细胞外基质重建、心肌间质增殖等。心肌细胞蛋白合成增加,可导致心肌细胞体积增大,即心肌细胞肥大。研究证实,心肌细胞肥大的形成需要刺激信号、信号传导、细胞核内基因转录活化以及心肌表型转化等四个环节,其最终效应是心肌表型由“成熟型”向“胚胎型”转化。对于心肌肥厚的机制已有诸多研究,但其具体发生机制仍未明确,因而尚没有可以确切有效预防心肌肥厚的方法。目前研究证实,在心肌肥厚的过程中,一组通常在胎儿心脏发育过程中表达的基因被重新表达,参与了心肌肥厚的病理调控。组蛋白是真核生物染色质的组成部分,组蛋白亚基的氨基端游离称为组蛋白尾巴,组蛋白尾巴上的许多残基可以被共价修饰,不同残基的不同修饰可以产生各种不同的信号,由其他信号蛋白识别,从而可调控真核生物的基因表达,导致转录激活或基因沉默,进而产生多种生物学效应。已有研究表明,组蛋白修饰与多种疾病的发病密切相关。如慢性肾脏病、肿瘤性疾病、神经系统疾病、内分泌系统疾病等,在心血管领域,组蛋白修饰也发挥了重要作用。PHD锌指蛋白8(PHF8)是近年来新发现的一种组蛋白去甲基化酶,可在体内通过对组蛋白的赖氨酸残基进行去甲基化修饰来调节基因的表达。PHF8是组蛋白去甲基化酶JmjC家族中的一个成员,JmjC家族成员在正常的个体发育、分化、内分泌的调节及多种疾病的发生发展中参与重要的调节作用。PHF8作为JmjC家族中的一员,它可以特异性去除抑制性组蛋白标记H4K20mel和H3K9mel/2,而结合活性组蛋白标志H3K4me3,在组蛋白修饰中发挥重要作用并参与发育调节及多种疾病的发生发展。但PHF8在心血管系统尤其心肌肥厚中的作用尚不明确。本课题将从体内和体外两个部分设计试验,旨在探讨PHF8在心肌肥厚发病中的作用,并初步探讨其作用的分子生物学机制,从而为防治心肌肥厚寻找新的契机和治疗靶点。材料与方法1.转基因动物模型的建立：构建心脏特异性人PHF8基因转基因(PHF8-Tg)小鼠。2.心肌肥厚动物模型的建立：通过主动脉缩窄术(TAC)建立压力负荷诱导的心肌肥厚小鼠模型。3.小鼠超声心动图：小鼠心脏超声检测小鼠心脏结构和功能。4.细胞培养及模型建立：提取原代新生大鼠心肌细胞(NRMCs)并培养,体外以苯肾上腺素(PE)等刺激诱导NRMCs发生肥大性生长反应。5.细胞内PHF8干预：采用腺病毒载体转染的方式干预NRMCs中PHF8的表达.6.HE染色、麦胚凝集素染色、Masson染色：分别显示心肌的大体结构、心肌细胞大小及心肌纤维化程度。7.免疫印迹：用于在蛋白水平检测组织和细胞中PHF8、ANP及相关信号通路蛋白的表达变化。8. RT-PCR:用于在基因水平检测组织和细胞中PHF8、ANP、β-MHC、BNP及相关信号通路mRNA水平的变化。9.3H-亮氨酸掺入试验：用于检测心肌细胞中蛋白质合成水平。10.荧光酶活性检测：用于检测心肌细胞中胚胎基因的启动子活性。11.免疫荧光分析：用于检测心肌细胞的大小。研究结果1.病理性心肌肥厚下调PHF8水平：在TAC手术后4周野生型C57BL/6小鼠的心肌中,PHF8的表达显著下降,在PE刺激的肥大性生长的NRMCs中,我们得到了相似的结论。这些研究结果表明PHF8可能参与了心肌细胞病理性肥大的过程。2.PHF8过表达抑制压力负荷下的心肌重构：接受TAC术4周后,PHF8-Tg小鼠的心功能显著优于野生型(WT)小鼠,左心室纤维化面积相比WT小鼠显著减小,纤维化标记物(COL1A1, COL3A1, CTGF, TGF β 1,纤连蛋白和α-SMA)和肥厚性胎儿基因(ANP, BNP, β-MHC, ACTAl和IL-6)的表达在PHF8-Tg小鼠也显著下调,这些结果表明,PHF8可抑制压力负荷诱导的病理性心肌重构。3.PHF8调节NRMCs肥厚性生长：PHF8过表达可抑制PE诱导的肥厚性胎儿基因表达并下调其启动子活性,而PHF8敲除则促进PE诱导的肥厚性胎儿基因表达并上调其启动子活性。研究结果表明,PHF8在体外负向调节心肌细胞肥大反应。4.PHF8调节AKT-mTOR信号通路：PHF8过表达显著降低TAC诱导的Akt和mTOR的磷酸化,这表明PHF8过表达阻断TAC诱导的Akt-mTOR信号通路。敲除PHF8则促进了PE诱导的AKT-mTOR途径的激活。5.雷帕霉素可修复PHF8表型缺失：我们发现雷帕霉素抑制PE诱导的NRCMs肥大性生长,也抑制PE诱导的ANP和β-MHC的蛋白质合成和启动子活化,并且PHF8敲除诱导的ANP和β-MHC蛋白质合成和增生性基因表达的上调被完全阻断。因此,雷帕霉素可修复PHF8表型缺陷。结论及意义1.PHF8能抑制压力负荷下心肌重塑及心肌细胞肥大性生长；2.PHF8抑制心肌细胞肥大性生长的作用可能是通过AKT-mTOR信号通路实现的；3.PHF8可能起到类似雷帕霉素抗心肌肥厚的作用。4.在本实验研究中,我们分别在体内及体外水平研究了PHF8对心肌肥厚的抑制作用,并初步探讨了其作用的分子生物学机制,以期为临床防治心肌肥厚提供新的思路和治疗靶点。