论文部分内容阅读
碱性果胶酶在纺织行业中的广泛应用很有前景,主要可用于苎麻脱胶和棉织物前处理的精练工艺,与传统的高温碱煮方法相比,具有保护纤维、降低能耗和化学污染且更加环境友好等优势。获得高表达的碱性果胶酶基因工程菌,低成本生产碱性果胶酶在纺织工业应用上具有重要的意义。在前期研究中,来源于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168的碱性果胶酶基因pel经过密码子优化后利用载体pHBM905BDM已经在毕赤酵母Pichia pastoris GS115中表达。本研究一是通过多相筛选提高果胶酶在毕赤酵母的表达量;二是通过分子改造提高碱性果胶酶的比酶活和热稳定性。一、多相筛选提高碱性果胶酶在酵母中的表达量首先大量转化重组质粒pHBM905BDM-pels到GS115中,利用组氨酸营养缺陷型(HIS4)筛选标记得到转化子,通过果胶底物平板筛选水解圈大的转化子进行摇瓶发酵复筛从而获得菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,摇瓶发酵酶活为536 U/m L。随后构建重组质粒pPIC9K-pels,电转化菌株GS115-pHBM905BDM-pels4,利用抗生素G418进行筛选,理论上整合到酵母基因组上拷贝数越多的转化子对G418的耐受性越强,由此在含4 mg/m L的G418平板上得到菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1,摇瓶发酵酶活为770 U/mL,通过qRT-PCR分析,菌株GS115-pHBM905BDM-pPIC9K-pels1含有7个拷贝目的基因。最后将该菌株在5 L的发酵罐中进行高密度发酵,碱性果胶酶酶活进一步提高至2271 U/mL。二、分子改造提高碱性果胶酶的比酶活和热稳定性前期研究工作中,碱性果胶酶基因pel也在大肠杆菌里进行了表达,重组蛋白的比酶活为353 U/mg,在50℃时的半衰期为2 h,该蛋白的晶体结构已经被解析,经过理性设计突变位点,得到了一个比酶活提高了1.32倍,pH稳定性也提高的突变体V132F。为了使PEL168能更加高效且稳定的应用于工业生产中,本研究继续对PEL168进行分子改造,以期得到比酶活和热稳定性进一步提高的碱性果胶酶突变体。1)理性设计:基于PEL168的三级结构进行理性设计,尝试引入二硫键以提高热稳定性,将第170位和第173位B突变为C,希望产生新的二硫键以增强局部结构的稳定性,但突变体完全丧失活性。2)随机突变:以碱性果胶酶基因pel为模板进行error-prone PCR建立突变体文库,通过果胶底物平板初筛和96孔板复筛得到一个比酶活提高1.81倍的突变体K47E(640U/mg),在50℃时的半衰期也延长至4.5 h。3)组合突变:考虑到有利突变的累积效应,将前期工作获得的比酶活提高,pH稳定性提高的突变体V132F和突变体库筛选到的突变体K47E进行组合突变,得到双突变体K47E/V132F,其比酶活提高至873 U/mg,与预期一致。4)定点饱和突变:由于第47号位点的突变是随机得到的,说明该位点对PEL168的比酶活有着重要的影响,随后以双突变体K47E/V132F为模板对47号位点进行饱和突变,筛选到比酶活提高至1388 U/mg的突变体K47D/V132F。5)同源比对设计突变位点:根据文献报道的嗜热果胶酶,从数据库中选取了5个来源于嗜热菌株或者最适温度较高的碱性果胶酶与PEL168进行同源序列比对,在活性中心附近确定了突变位点R272W从而得到突变体K47D/V132F/R272W,相对于野生型PEL168来说,其比酶活提高了4.37倍(1544 U/mg),在50℃时的半衰期也延长至5.6 h,测定动力学参数发现其催化效率也明显提高。6)结构分析:基于PEL168已解析的结构进行同源建模,结构分析发现K47D/V132F/R272W催化三联体的空间距离增加,使得底物更加容易与活性中心结合,且非共价键的增加使得催化三联体的结构也变得更加稳定,从而突变体的比酶活提高;47号位点氨基酸残基处的氢键增加,且通过计算机模拟计算突变体蛋白的折叠自由能减少,使得蛋白结构变得更加稳定。三、突变体对织物煮练的效果分析为了测试该碱性果胶酶是否可用于织物的生物精练,用胚布进行了酶法煮练的小试,发现用突变体酶K47D/V132F/R272W处理胚布后,胚布的润湿性明显增强,润湿圈面积为14.13 cm~2,布料也变得更加柔软,而未经酶处理的布润湿性很差,润湿圈面积只有2.00 cm~2。在扫描电子显微镜(SEM)下观察胚布的微观结构,发现经过酶处理后的纤维更加光滑,这些结果说明该碱性果胶酶可以很好的应用于生物煮练中。