【摘 要】
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鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）感染引起鸡的慢性呼吸道病（Chronic respiratory disease,CRD）。CRD广泛存在于所有的养禽国家,迄今仍未找到有效的防控措施,给家禽业造成巨大的经济损失。为探寻新颖的防治措施,急需深入研究MG的致病机制。研究表明,micro RNAs（mi RNA）在很多病原菌的致病中起重要的作用。课题组前期高通量测序发
【基金项目】
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国家自然科学基金（31972681）；
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鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum,MG）感染引起鸡的慢性呼吸道病（Chronic respiratory disease,CRD）。CRD广泛存在于所有的养禽国家,迄今仍未找到有效的防控措施,给家禽业造成巨大的经济损失。为探寻新颖的防治措施,急需深入研究MG的致病机制。研究表明,micro RNAs（mi RNA）在很多病原菌的致病中起重要的作用。课题组前期高通量测序发现MG-HS感染能够显著降低gga-mi R-365-3p的表达量,本课题旨在探究gga-mi R-365-3p在MG-HS致病中的作用及其免疫调控机制,为阐明MG的致病机制提供理论依据。主要结果如下:1.成功构建了MG感染的CP-Ⅱ细胞模型,q PCR结果显示,与正常细胞相比,MG感染细胞8h,细胞内gga-mi R-365-3p的表达量极显著升高（P＜0.01）;而感染24h,细胞内gga-mi R-365-3p的表达量极显著降低（P＜0.01）。细胞中过表达gga-mi R-365-3p能极显著抑制MG黏附蛋白（p MGA1.2）的m RNA表达量（P＜0.01）;抑制gga-mi R-365-3p能显著促进p MGA1.2的m RNA表达量（P＜0.05）。2.利用mi RDB和Targetscan在线软件预测SOCS5可能是gga-mi R-365-3p的靶基因;双荧光素酶报告基因系统检测发现gga-mi R-365-3p的种子序列与SOCS53’UTR（1989-1995bp）结合;RT-q PCR及WB检测显示,细胞中超表达gga-mi R-365-3p能极显著降低SOCS5的m RNA与蛋白表达量（P＜0.01）,而抑制gga-mi R-365-3p后结果相反（P＜0.05）;与正常CP-Ⅱ细胞相比,MG感染细胞8h,细胞内SOCS5表达量极显著降低（P＜0.01）;而感染24h,细胞内SOCS5表达量极显著升高（P＜0.01）,证明SOCS5是gga-mi R-365-3p的直接靶基因,且其受到gga-mi R-365-3p的负调控。3.超表达gga-mi R-365-3p能显著提高MG感染的CP-Ⅱ细胞中STAT1和STAT3m RNA的表达量（P＜0.05）,显著增加JAK1、STAT1和STAT3蛋白磷酸化水平,促进caspase-3活化,显著降低BCL2和BCLXL m RNA及蛋白水平（P＜0.05）;抑制gga-mi R-365-3p后呈相反的结果。SOCS5超表达或AG490阻断JAK/STAT信号通路后,能显著抑制MG感染CP-Ⅱ细胞中JAK1、STAT1和STAT3的蛋白磷酸化水平,抑制caspase-3的活化,提高BCL2和BCLXL的m RNA与蛋白表达量（P＜0.05）,显著提高感染细胞内p MGA1.2的表达量（P＜0.05）;si RNA特异性抑制SOCS5后呈相反结果（P＜0.05）。同时过表达gga-mi R-365-3p可削弱SOCS5超表达的效果（P＜0.05）。4.gga-mi R-365-3p过表达抑制MG感染的CP-Ⅱ细胞增殖,促进凋亡（P＜0.05）;抑制gga-mi R-365-3p后呈相反结果（P＜0.05）。SOCS5超表达或AG490阻断JAK/STAT信号通路后,能促进MG感染的CP-Ⅱ细胞增殖,抑制凋亡（P＜0.05）;si RNA特异性抑制SOCS5后呈相反结果（P＜0.05）。gga-mi R-365-3p过表达可显著减弱SOCS5超表达对感染细胞增殖与凋亡的影响（P＜0.05）。5.抑制gga-mi R-365-3p、超表达SOCS5和JAK/STAT通路抑制剂AG490均能显著降低MG感染的CP-Ⅱ细胞炎性因子TNF-α和IL-6的分泌（P＜0.05）;超表达gga-mi R-365-3p,敲低SOCS5则显著提高感染细胞炎性因子TNF-α和IL-6的分泌（P＜0.05）。6.SOCS5超表达能极显著提高MG感染的CP-Ⅱ细胞中gga-mi R-365-3p的表达量（P＜0.01）,而AG490阻断JAK/STAT信号通路后能极显著抑制感染细胞中gga-mi R-365-3p的表达水平（P＜0.01）,说明gga-mi R-365-3p与JAK/STAT信号通路之间存在负反馈回路。总之,MG通过降低细胞内gga-mi R-365-3p的表达量,抑制JAK/STAT信号通路,促进感染细胞增殖,抑制细胞凋亡,并使炎性因子分泌减少,从而逃避宿主免疫,促进对细胞的黏附或侵袭。
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