G-四链体（G4）是一种由富含鸟嘌呤（G）核酸序列形成的独特的二级结构,广泛分布于真核生物基因组,在端粒维持、遗传不稳定性、DNA复制以及基因表达与调控等方面具有重要作用。作为一种非经典的核酸二级结构,G4结构同样存在于病毒的基因组中。近年来,有关G4结构在病毒复制中的生物学功能受到越来越多的关注,G4结构在调控病毒蛋白合成以及病毒增殖过程中发挥重要作用。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组全长约15 kb。PRRSV复制需要以负链的RNA中间体为模板合成基因组RNA和一系列亚基因组RNA。通过序列分析发现,PRRSV复制中间体RNA上存在两段富G序列,可能形成G4结构。基于此,本课题采用一系列生物化学实验对PRRSV复制中间体RNA上的G4进行分析,并进一步研究G4结构在PRRSV感染中的功能,有望更加深入地了解PRRSV复制的复杂机制,为以G4结构为靶标的新型药物和疫苗研发提供理论依据。主要研究内容如下:1.PRRSV负链RNA上G-四链体可形成序列的鉴定及保守性分析通过生物信息学和QGRS Mapper软件分析PRRSV基因组及其负链RNA序列,发现在PRRSV负链RNA存在两段富含G的序列,符合经典G-四链体可形成序列特征G≥3N1-7G≥3N1-7G≥3N1-7G≥3,且显示出很高的形成G-四链体结构的潜力,将其分别命名为G4-1（GGGCCGGUACGGGAGGGGGCAGGG）和G4-2（GGGUGGGGGUGCGGGGGUUGGG）。随后对其进行序列比对分析,发现这两段富G序列在PRRSV不同毒株间相对保守。2.PRRSV G4-1和G4-2的结构分析为了验证这两段富G序列是否能够形成G4结构,合成了这两段富G序列及其突变体（突变其中的部分G）,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测RNA G4-1和G4-2中G4结构的形成。结果显示,与突变体相比,G4-1和G4-2存在迁移速度更快的条带,表明G4-1和G4-2折叠成了稳定的单分子G4结构,结构更为紧凑,迁移速度更快。圆二色光谱（CD）实验结果显示,G4-1和G4-2的在240 nm左右出现负峰和260 nm左右出现正峰,说明RNA G4-1和G4-2形成平行型G4结构。3.PRRSV G4-1和G4-2抑制EGFP蛋白表达为了进一步了解PRRSV负链RNA上G-四链体结构潜在的生物学功能,将鉴定到的两段富G序列及其突变体序列分别插入到p EGFP-C1载体中EGFP报告基因的N端,然后检测G-四链体稳定剂PDS对EGFP荧光表达的影响。结果显示,PDS能够显著抑制p EGFP-G4-1、p EGFP-G4-2的EGFP荧光表达,而对其突变体的抑制效果明显减弱。以上结果说明G-四链体稳定剂PDS通过靶向PRRSV负链RNA G-四链体结构下调EGFP报告基因的表达。4.G-四链体稳定剂PDS和BRACO-19抑制PRRSV增殖上述研究已证明PRRSV负链RNA中间体上的两段富G序列能够形成G-四链体结构,为了检测G4结构的形成对PRRSV增殖的影响,本研究选取了两种G-四链体稳定剂PDS和BRACO-19,探究其对PRRSV增殖的影响。结果表明,PDS和BRACO-19能够通过靶向PRRSV负链RNA上G4结构抑制PRRSV在i PAM细胞上的增殖。5.解旋PRRSV负链RNA中间体上G-四链体结构促进PRRSV增殖既然PRRSV负链RNA中间体上形成的G4结构不利于其增殖,推测PRRSV在感染过程中需要借助病毒或宿主的解旋酶解旋该结构,进而促进其基因组的正常复制。通过链霉亲和素pull down实验结合质谱分析,鉴定了能够与PRRSV G4结合的宿主解旋酶DDX18以及病毒解旋酶nsp10。进一步研究显示,PRRSV能够协同利用自身解旋酶nsp10和宿主解旋酶DDX18解旋其负链RNA上形成的G4结构进而促进PRRSV的增殖。