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肌腱主要由致密结缔组织构成,其作用主要是将肌肉产生的牵拉力传递给骨骼,从而驱动骨骼运动。然而,反复快速或过度的拉伸往往会导致肌腱损伤甚至断裂。由于肌腱组织寡血管,营养供应较差,损伤肌腱的修复过程很缓慢。已有研究表明,在损伤肌腱修复早期,新生血管的形成是必要的。然而,在修复后期过度的血管生成会加剧疤痕和粘连的形成,导致疼痛和功能障碍。它们可能是由于低氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)及其转录靶点血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)和血小板衍生生长因子B(platelet-derived growth factor B,PDGFB)的表达水平升高导致的,但潜在的分子机制尚不清楚。本文以大鼠肌腱细胞为研究对象,利用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导肌腱细胞炎症因子环氧化合酶2(Cyclooxygenase,COX2)的高表达,构建肌腱细胞炎症损伤模型,并进一步研究了COX2促进肌腱血管新生的分子机理。检测HIF-1α表达和对下游血管生成基因VEGFA和PDGFB的转录激活,考察了COX2、HIF-1α、p300和p53的相互作用,最后研究了组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(Trostatin A,TSA)通过调控p53-HIF-1α-VEGFA/PDGFB信号通路,抑制炎性肌腱细胞血管新生的作用。主要实验结果如下:(1)LPS通过COX2炎症因子诱导肌腱细胞炎症反应本研究采用组织块贴壁培养法分离培养大鼠原代肌腱细胞,肌腱细胞从肌腱组织块中爬出,并在组织块周围成集落状均匀生长,细胞质均匀,呈长梭形,排列紧凑,P1代与P0代的细胞形态基本一致。通过q PCR和Western blot检测肌腱细胞的相关标志分子发现,体外分离培养的大鼠肌腱细胞在mRNA和蛋白水平均表达Tenomodulin、Scleraxis、Tenascin C和Collagen I,可确认分离培养的细胞为肌腱细胞。通过q PCR检测LPS处理后肌腱细胞NF-κB(p50/p65)通路下游炎症因子和血管内皮生长因子VEGFA mRNA表达水平,发现COX2表达显著提高,而其他炎症因子上调不显著。在LPS处理肌腱细胞12 h后,VEGFA mRNA表达水平显著上升。(2)COX2通过HIF-1α-VEGFA/PDGFB信号通路促进血管新生使用COX2-siRNA或p CDH-COX2下调或上调肌腱细胞中COX2的表达,结果发现,COX2、HIF-1α和VEGFA在肌腱细胞中的表达呈正相关,使用COX2-siRNA在肌腱细胞中敲减COX2,LPS诱导的HIF-lα的表达降低,而过表达COX2则促进了HIF-lα和VEGFA的表达,且在大鼠主动脉血管内皮细胞(rat aortic vascular endothelial cells,RAOECs)中敲减VEGFA的受体VEGFR2,RAOECs的成管能力显著下降,表明VEGFA的表达上调,确实促进了RAOECs的成管,但是敲减RAOECs中的VEGFR2并没有完全抑制RAOECs的成管,推测过表达COX2的肌腱细胞还可能通过其它信号通路调控血管新生。PDGFB是一种肽调节因子,刺激结缔组织中成纤维细胞的形成和血管新生中发挥作用,目前有研究报道PDGFB在机体手术后和损伤修复过程中表达增加。本研究中,敲减PDGFB的受体PDGFRβ对RAOECs的成管能力抑制的作用比敲减VEGFR2更强,而且同时敲减PDGFRβ和VEGFR2则进一步抑制了RAOECs的成管能力,说明过表达COX2的肌腱细胞同时通过这两条信号通路发挥促血管新生的作用,而且PDGFB信号通路可能发挥更主要的作用。另外,最新报道称HIF-lα也与PDGFB的启动子区结合,提示HIF-1α也可能靶向PDGFB,调控血管新生。我们进一步通过双荧光素酶报告基因实验,从蛋白与DNA相互作用的角度分析其分子机理,结果发现:肌腱细胞中过表达COX2可显著增强VEGFA和PDGFB启动子活性,且对PDGFB启动子的激活程度更显著。(3)TSA通过调控p53-HIF-1α-VEGFA/PDGFB信号通路,抑制肌腱细胞的促血管新生能力。用组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理过表达COX2的炎性肌腱细胞,HIF-1α及其转录靶点VEGFA和PDGFB的表达水平降低,导致RAOECs的成管反应被抑制。用蛋白免疫沉淀法(co-immunoprecipitation,Co-IP)检测COX2、p53和HIF-1α的相互作用,以及p53、p300和HIF-1α的相互作用,结果显示,COX2、p53和HIF-1α以及p300与HIF-1α在过表达COX2的肌腱细胞中可直接相互作用;TSA添加后,COX2与HIF-1α以及p300与HIF-1α的相互作用降低,而COX2与p53以及p53与HIF-1α的相互作用不变;值得注意的是,在过表达COX2的肌腱细胞中p53与p300没有发生相互作用,但是在添加TSA后它们则可以发生相互作用。因此,TSA抑制COX2和p300与HIF-1α的结合,同时促进p300与p53的结合,这可能是其抑制血管生成的原因。双荧光素酶报告基因和染色质免疫共沉淀实验(chromatin-immune precipitation,ChIP)证明,过表达COX2的肌腱细胞中,COX2可促进HIF-1α与下游VEGFA和PDGFB启动子的结合并激活其转录,且HIF-1α对PDGFB启动子的结合和激活能力更强,而TSA可以抑制HIF-1α与两者的结合和激活,同样对PDGFB的抑制更强。(4)TSA对SD大鼠损伤跟腱修复的影响构建SD大鼠跟腱损伤模型,利用跟腱功能指数(Achilles functional index,AFI)和组织学评价检测TSA对SD大鼠跟腱损伤修复的影响。结果表明,TSA处理显著增加SD大鼠跟腱修复的AFI,组织学观察发现TSA处理组肉芽组织、粘连和瘢痕的形成减少。苏木素-伊红(Hematoxylin and eosin,HE)染色结果显示TSA处理组较对照组肌腱细胞数量减少,炎性细胞浸润减少,且细胞外基质更丰富。此外,Masson染色证明TSA处理组比对照组含有更加丰富的胶原纤维,且排列更加整齐,相较于对照组TSA处理组组织学分数更高。提示TSA可能通过抑制过度的血管新生,抑制肉芽组织形成,减少粘连和瘢痕,从而促进损伤肌腱的修复,而且在损伤后第14 d加入TSA作用相比第7 d能取得更好的效果。综合上述实验结果:通过比较VEGFA和PDGFB受体敲减对RAOECs成管能力的影响,VEGFA和PDGFB的启动子转录活性,以及HIF-1α与VEGFA和PDGFB的启动子的结合能力,可以发现HIF-1α/PDGFB通路比HIF-1α/VEGFA通路在肌腱细胞血管生成中发挥更重要的作用,TSA主要通过提高肌腱细胞总乙酰化水平调控HIF-1α/PDGFB通路来缓解血管生成。