PA-X是由Jagger等人在2012年发现的一种由于PA基因发生+1核糖体移码产生的一种新型蛋白。目前关于PA-X的功能研究主要围绕1918年西班牙H1N1人流感病毒、2009年甲型H1N1人流感病毒、高致病性H5N1及H9N2禽流感病毒进行。然而,PA-X对于猪流感病毒复制和致病能力的影响仍旧没有得到证明。为了探究PA-X蛋白对猪流感病毒复制和致病能力的影响,我们在古典H1N1亚型猪流感病毒的反向遗传操作平台基础上,通过点突变构建了PA-X缺失的重组质粒,拯救了野生株和PA-X缺失株。通过比较野生株和PA-X缺失株在体外细胞系和小鼠体内的复制和致病能力来解析PA-X对猪流感病毒生物学特性的影响。此外,我们还比较了野生株和PA-X缺失株聚合酶活性的差异。研究结果表明:PA-X缺失明显增强了古典H1N1亚型猪流感病毒在MDCK和A549细胞上的复制水平,在PK-15细胞上两者的复制能力虽然没有明显的差异,但缺失株也略高于野生株;PA-X缺失导致病毒在小鼠肺脏的复制能力得到提高,肺脏的病变更加严重,表现为体重下降幅度增大,致死率提高;PA-X缺失后猪流感病毒的聚合酶活性提高。大多数情况下PA-X的C末端由X-ORF编码的61个氨基酸构成,但在某些情况下,X-ORF会由于在第42个密码子处TGG(Trp)突变为TAG(终止密码子)而编码只有41个氨基酸的短肽。本研究中野生毒株表达的X部分只有41个氨基酸,为了探究C端20个氨基酸对古典H1N1亚型猪流感病毒复制和致病能力的影响,我们将野生毒株的PTC进行突变,构建表达全长PA-X的重组质粒,拯救PA-X恢复全长的突变毒株,然后通过体内外试验探究20个氨基酸对病毒的影响。研究结果表明:PA-X恢复全长后,病毒在MDCK、A549细胞上的复制能力得到明显提高,在PK-15细胞上PA-X恢复全长株的复制能力也稍微高于野生株;PA-X恢复全长后,小鼠的体重下降增多,死亡率提高,肺脏病变加重,病毒在肺脏中的复制速度加快,表明C端20个氨基酸对病毒的复制和致病能力起着非常重要的作用;PA-X恢复全长导致病毒的聚合酶活性提高。PB2-627K是决定流感病毒宿主适应性的一个重要因素,研究表明PB2-627K能够提高禽流感病毒、人流感病毒、古典H1N1亚型猪流感病毒和三源重组猪流感病毒在小鼠模型上的致病力。猪流感病毒PB2基因的遗传演化分析结果表明,人源H3N2亚型猪流感病毒PB2基因与古典H1N1和三源重组毒株的遗传差异均很大,而且关于PB2-627这一位点对于人源H3N2亚型猪流感病毒复制和致病能力的影响,目前国内外还没有相关研究。本研究中,我们首先成功构建了人源H3N2亚型猪流感病毒的反向遗传操作系统,通过点突变技术将重组质粒的PB2-627位由K突变为E,进而进行野生株和突变株的拯救,然后通过细胞和小鼠上的试验比较突变前后病毒的复制和致病能力的变化,研究结果证明:PB2-627位由K突变为E后,病毒在MDCK、A549、PK-15细胞上的复制能力明显下降;在MDCK细胞上形成的空斑形态和大小比较结果也证明627K野生株比627E突变株的复制能力更强;627E毒株的聚合酶活性明显低于627 K毒株;PB2-K627E突变使病毒对小鼠的致病力和在小鼠肺脏内的复制能力均明显下降。