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禽大肠杆菌病是家禽最常见的细菌病之一,给养禽业造成了严重的经济损失。禽大肠杆菌病(Avian Colibacillosis)是指部分或全部由禽病原性大肠杆菌(Avian PathogenicEscheichia coli,APEC)所引起的局部或全身性感染的疾病,包括大肠杆菌性败血症、大肠杆菌肉芽肿(Hjarre氏病)、气囊病(慢性呼吸道病,CRD),禽蜂窝织炎、肿头综合症、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、全眼球炎及脐炎/卵黄囊感染。抗菌药在控制大肠杆菌感染方面发挥了重要作用,但随着抗菌药物的广泛应用,导致大肠杆菌耐药株尤其是多重耐药菌株不断出现,大肠杆菌的耐药问题已成为影响人类健康和养殉业发展的重要因素。因此,对人肠杆菌耐药性进行调查研究,从基因水平上探讨耐药性产生的分子机制以及指导临床用药都具有重要的意义。1.鸭源致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析2007年2～12月间,从四川、重庆部分地区养鸭场采集发生大肠杆菌病的病死鸭的内脏,无菌处理病料表面,采用常规三区划线分离细菌。通过镜检、生化试验,共得到65株鸭致病性大肠杆菌。用大肠杆菌0血清型多因子血清及单因子血清,采用玻板和试管凝集试验,对所分离得到的菌株进行0血清型鉴定。分离的65株致病性大肠杆菌(E.col i)中鉴定出49株的血清型,占分离菌株的75.4%,另外15株未能定型,3株自凝。这些定型菌株覆盖了15个血清型,但以078,021,01,093等4个血清型检出率最高,共鉴定出26株,占定型菌株的53%。检测结果表明:078,021,01,093等血清型为四川、重庆鸭源性大肠杆菌的优势血清型。另外血清型鉴定检出率较低的还有11个分离株,占定型菌株的47%。从不同地区分离得到的菌株的血清型种类和主要血清型有所不同,078血清型在大部分地区的分离菌株中都是主要血清型。采用世界卫生组织(WHO)推荐的K-B纸片扩散法,按照美国临床实验室标准化委员会(NCCLS的判定标准,以ATCC25922标准质控菌做对照,选用21种常用抗生素对分离得到的65株鸭大肠杆菌进行药敏实验,结果显示,鸭源大肠杆菌分离株耐药现象已经很严重,细菌的多重耐药十分普遍,最多耐药20种,耐10种药物以上的有53株(占81.5%)。在21种抗菌素中,对林可霉素和红霉素的耐药率最高,达96.5%,对利福平、磺胺异噁唑、氨苄青霉素、磺胺甲基异噁唑、阿莫西林、四环素、链霉素等药物的也表现出很高的耐药性,耐药率均超过了70%。妥布霉素抑菌作用最强,敏感株占73.8%。对不同地区的耐荮隋况进行比较,结果发现,分离自不同地区的受试菌株对药物的耐受情况不同。2.鸭源致病性大肠杆菌耐药基因及Ⅰ型整合子酶的PCR检测抗菌药物是临床治疗大肠杆菌病的重要手段,长期应用与不合理使用使得药物效果不尽理想。本研究参照GenBank中耐药基因相关序列,设计引物,对耐氨基糖苷类药物相关基因aphA、rpsL、rrsA,耐β-内酰胺类药物相关基因bla-TEM、SHV,耐磺胺类药物相关基因Dhps,耐喹诺酮类药物相关基因gyrA、parC,Ⅰ型整合酶intⅠ等进行了PCR扩增。对本次分离的65株鸭致病性大肠杆菌进行药物抗性基因的分子流行病学检测,结果表明:gyrA、parC阳性率最高,达到100%;aphA、Dhps,rpsL的阳性率超过80%,分别为95.4%,90.8%和80%;rrsA bla-TEM和SHV的阳性率较低,分别为13.8%,46.2%和27.7%。多数菌株携带有多种耐药基因,一个菌株同时携带3种以上耐药基因的有64株,占到了全部测试菌株的98.5%,最多的携带了8种被检测的耐药基因,大多数携带了3至5种耐药基因。对分离菌株的intⅠ的检测表明,intⅠ阳性检测率达78.5%。本试验结果显示,在四川、重庆部分地区养鸭场,感染鸭的大肠杆菌的耐药性与相关耐药基因的检出率基本呈正相关,说明兽医临床上的日益严重的耐药现象与耐药基因的普遍存在有着很大的关系,并提示控制禽源耐药细菌对食品安全及人类健康有重要意义。3.鸭源致病性大肠杆菌热休克蛋白70mRNA的研究采用热休克诱导法分别给予质控菌株ATCC25922、耐药菌株非致死性的高温(42℃)恒温振荡培养,先在37℃,180rpm恒温振荡培养2h,再在42℃培养3h,收集菌体。通过RT-PCR检测鸭大肠杆菌HSP70mRNA的表达情况。(1)质控菌株ATCC25922在37℃下培养,经RT-PCR检测,没有发现hsp70mRNA的表达,而温度提高到42℃后,hsp70mRNA有较高表达;受试菌YY1在37、42℃培养,hsp70mRNA均有较高表达。(2)采用Bio-rad Quantity One软件分析,经热处理的菌株hsp70mRNA灰度值高于未经热处理菌株,受试菌YY1热处理株hsp70mRNA灰度值高于未热处理株。表明细菌在药物的胁迫下,应激蛋白表达量增加,提高细菌的耐受性,对细菌具有保护作用。因此,把HSP70用于对细菌耐药性的监测的生物标志物,具有一定可行性和重要的意义,但需要进一步开展深入的研究。