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基因控制着人类生命的生老病死过程,随着对基因与有关病症的了解,在分子水平上检测易感物种及基因突变,对于疾病的治疗及预后有着重要的意义。随着分子生物学和生物技术的发展, DNA分子的识别技术不断提高。DNA传感器的出现使对目的DNA的测量时间大大缩短,既可定性又可定量,且灵敏度高、选择性好,近年来受到了人们的广泛重视。DNA传感器是集生物分子学技术、现代物理、现代化学、微电子技术于一体而发展起来的新型基因分析技术,可以实现对基因疾病的诊断、传染病的检测、环境监控、药物研究、法医鉴定及食品分析等领域的监测与分析。根据信号转换和检测方法的不同,DNA传感器可分为电化学传感器、光学传感器、石英晶体传感器等。当前,纳米技术与生物传感技术相结合是DNA传感器发展的一大趋势。纳米材料具有独特的物理和化学性质,如量子尺寸效应、小尺寸效应、表面效应和量子隧道效应。功能纳米颗粒(电子、光和磁)可与DNA分子连接,使DNA传感信号得以放大。纳米金颗粒由于制备过程简单,粒径可控,而且具有很好的生物相容性,容易与DNA结合,成为非常适合于在DNA传感器中进行生物标记的纳米粒子。检测灵敏度是DNA传感器一个最重要的性质,本论文在几种不同的DNA检测方法中,以纳米金颗粒为DNA标记物,探索提高DNA传感器检测灵敏度的途径。本论文内容包括以下几个方面:1.聚丙烯基材上的金标银染DNA检测采用聚丙烯微孔膜和致密聚丙烯片为基材,经过氢气/氮气低温等离子技术改性后在其表面接枝活性氨基,以提供原位合成DNA探针序列的活性位点。同时为了开发出适合大面积快速印刷制备生物芯片的方法,对原位合成过程中的氧化剂进行了改进。原位合成后的DNA探针与纳米金标记的靶DNA杂交后进行银染放大检测。实验表明,采用I2/Ac2O/AcOH/THF氧化体系替代I2/H2O/Pyridine/THF氧化体系进行DNA原位合成,可以消除试剂互串对原位合成效率的影响。其原位合成的偶联效率可达98.2%,而且不影响所合成的DNA探针阵列与靶序列杂交的特异性,可很好地区分碱基正错配。以H2和N2混合气体等离子体处理聚丙烯微孔膜和聚丙烯片,光电子能谱(XPS)证实在其表面分别接枝了大量活性氨基,可直接用于DNA的原位合成。实验成功地制备了13nm的胶体金,在聚丙烯片上原位合成DNA探针后的金标银染检测灵敏度达到100 fM,可明显区分碱基正错配,正配:错配一个碱基:错配二个碱基:错配三个碱基的杂交银染信号比为22:16:9:4。聚丙烯片上手工点样DNA探针后的检测灵敏度为100 pM,比原位合成法低3个数量级,而且同一样本DNA浓度下,手工点样的银染信号约为原位合成的1/2。聚丙烯膜上原位合成DNA探针后的金标银染检测信号强于带0.07μmol/ cm2表面氨基的商用聚丙烯膜,且可明显地区分碱基正错配,其金标银染杂交信号随着纳米金粒径和胶体金浓度的增加而增大。2.纳米金放大的电化学DNA检测将纳米材料混入碳糊电极中,分别在纳米碳管改性的碳糊电极和SBA-15分子筛改性的碳糊电极上通过亲和素-生物素法固定DNA探针,固定的探针与纳米金标记的靶DNA杂交后结合第一层胶体金颗粒,并通过layer-by-layer层层放大连接第二层胶体金,最后检测单层和双层纳米金的差分脉冲伏安(DPV)电化学信号。对固定在电极表面的DNA进行循环伏安扫描(CV)表明,在碳糊电极中加入纳米碳管制成的纳米碳糊电极(CNTPE)由于具有比纯碳糊电极(CPE)更大的吸附表面积,固定的DNA量更多,有利于DNA杂交。通过亲和素-生物素体系在电极表面固定DNA,纳米碳管的孔径越大,DNA的固定量越多,DNA的循环伏安(CV)信号也越强。随着电极中纳米碳管的含量增加,杂交信号增强。而碳糊电极经分子筛改性后,由于分子筛不导电,其DNA吸附和杂交的电化学响应信号均低于纯碳糊电极。在纳米碳糊电极表面,经过两次杂交的胶体金层层放大后,其DPV信号明显高于一次杂交的胶体金DPV信号,而且层层放大杂交能很好地区分正错配DNA序列。一次杂交对靶DNA的检测限为1nM,而层层放大的检测灵敏度可达100pM,比一次杂交高一个数量级。3.纳米金质量放大的压电DNA检测压电DNA检测属于对质量敏感的传感,由于纳米颗粒的质量远远大于DNA分子的质量,采用纳米金颗粒标记杂交的DNA,以增加石英金电极表面的质量改变量,并通过layer-by-layer层层放大连接更多的胶体金颗粒,最后检测由表面质量变化引起的频率改变值。实验表明,标记的胶体金确能增加石英晶体的频率检测信号。由于具有更高的杂交效率和胶体金标记效率,先杂交后标记胶体金的“追加标记法”比先标记胶体金后杂交的“直接标记法”具有更大的频率降。直接标记法中,频率改变值随纳米金的直径增大而增加,而追加标记法中,频率改变随纳米金直径的增加而减少。在追加标记法中,在杂交条件优化后,表面探针浓度为1μM,标记胶体金直径为5nm时,一次杂交放大的灵敏度为100fM,去除背景后,正配:错配一个碱基的频率降比值为2.27:1,胶体金层层放大的检测灵敏度为10 fM,去除背景后正配:错配一个碱基的频率降比值为2.13:1。经层层放大后的检测灵敏度比一次杂交时可提高一个数量级。层层放大杂交对MTHFR基因C677T突变纯合型的检测灵敏度达到10fM,并成功地实现了单碱基错配检测,正配:错配一个碱基的频率降比值为2.1:1。