威灵仙具有祛风湿、通经络的功效,在临床上主要用于风湿痹痛,肢体麻木,筋脉拘挛,屈伸不利等病症的治疗。2010版《中国药典》中规定威灵仙的来源为毛茛科植物威灵仙Clematis chinensis Osbeck.、棉团铁线莲Clematis hexapetala Pall.或东北铁线莲Clematis manshuria Rupr.的干燥根和根茎。通过检索文献,对历史上不同朝代的本草著作进行考证,从古至今被作为威灵仙当作药用的植物较多,在不同的历史时期以及不同的地区其入药品种有着较大差异,存在着严重的同物异名,同名异物现象。目前药材市场上流通的威灵仙药材,除了《中国药典》中规定的三种正品外,还存在着许多地方习用品以及混伪品,混伪品在化学成分、临床疗效等方面与正品均存在着很大的差异,严重影响到了药材市场的稳定发展以及临床的用药安全性,也影响到了科研研究及药物生产。因此,亟需对市场上的威灵仙药材品种进行整理。目前,中药材常用的鉴定方法主要有包括基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定等传统鉴定方法,以及正在不断发展的分子生药学方法。DNA条形码技术因其具有操作简便、快速、高效、准确等优点使其在中药鉴定方面备受关注。分子鉴定通常的鉴定方法为测序后,采用相似性搜索法和建树法利用相关软件对大量序列进行运算后实现对样本的准确鉴定,由于样本、序列数据库不全面、参比序列经常变化等问题的存在,使得分子鉴定的鉴定指标不够明确。因此,本实验以采集得到的东北铁线莲、棉团铁线莲的叶片样本测序扩增得到的序列和GenBank中的威灵仙及其混伪品序列为材料,通过构建东北铁线莲、棉团铁线莲的DNA条形码数据库,对数据库内序列进行研究,以相似度阈值、特异位点、聚类树作为鉴定指标,最终达到了对市场上威灵仙药材品种整理的目标。经过研究,取得以下结果：(1)构建东北铁线莲DNA条形码数据库。通过PCR扩增得到东北铁线莲ITS序列及psbA-trnH序列,构建其基因型数据库,分别为东北铁线莲的ITS序列数据库、东北铁线莲psbA-trnH序列数据库。其中东北铁线莲ITS序列数据库中共含有78个基因型,其中H1(11.36%)为核心基因型；东北铁线莲psbA-trnH序列数据库中共含有38个基因型,其中H1(37.18%)为核心基因型,东北铁线莲DNA条形码数据库的构建为鉴定指标的研究提供了基础。并基于本实验中获得的基因序列及相似度阈值,借助计算机语言编写了东北铁线莲的DNA条形码数据库检索系统,当用户在该系统内查询序列时,系统将显示出鉴定结果及药材名称、拉丁名、序列名称、匹配长度、GC含量及相似度等相关信息。管理员可以进行增加序列、查询序列、修改序列、删除序列及还原序列,以维护数据库的正常运行。(2)确定相似度阈值为鉴定指标。通过对DNA条形码数据库中的序列进行分析比对,利用软件分析相似度、特异位点、聚类树这三个指标,最终确定了与东北铁线莲DNA条形码数据库比较相似度100%的鉴定指标。相似度的计算具有方法便捷、分析步骤较少。(3)利用鉴定指标实现对市场上威灵仙药材品种的整理。本实验中利用构建的方法对26份药材样品进行了鉴定,鉴定结果为11份药材样品为东北铁线莲,2份药材样品为棉团铁线莲,1份药材样品为威灵仙,11份药材样品为混伪品紫金牛,有1份药材样品因染菌未能成功鉴定。通过鉴定结果可以发现市场威灵仙药材品种主要以东北铁线莲为主,棉团铁线莲和威灵仙较少,同时市场上威灵仙药材有着较多混伪品,市场上的混伪品为紫金牛科植物紫金牛,紫金牛Ardisia japonica为紫金牛科植物,为我国民间常用中草药及观赏植物,以全株及根入药,具有活血散瘀,镇咳祛痰,解毒等疗效。市场上威灵仙药材混伪现象严重,严重影响药材的安全性及有效性,有关部门应加大整治力度。