菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)是菊科菊属,多年生草本植物,是世界著名的观赏植物之一。菊花分为夏菊、秋菊和冬菊(寒菊),但以秋菊为主,这种固定的花期与人们四季赏菊的需求不再相符,所以控制菊花花期的研究备受关注。传统技术上诱导菊花提前开花主要是通过调控光周期和改变环境温度来实现的,成本较高。因此寻找更加便捷有效的调控花期分子生物学方法,更具有广阔的前景和推广价值。目前通过DNA甲基化转移酶抑制剂处理调控植物花期的研究已取得了一些进展。为了促进菊花提前开花的方法更适合生产应用,本研究利用5-氮杂胞苷(5-Azacytidine)和姜黄素两种甲基化酶抑制剂来设置不同的处理方式来处理55个菊花品种(包括组培苗和菊花插穗),然后以处理材料的再生植株为研究对象,通过生长发育指标测定、液相色谱、MSAP、转录组测序和荧光定量PCR等方法,研究了5-zaz C和姜黄素对菊花DNA甲基化水平及花期基因表达的影响。主要结果如下:(1)使用姜黄素和5-azaC处理菊花,产生了丰富的表型变异材料。利用姜黄素和5-azaC处理组培品种30 d后,分别有7个菊花品种的株高、10个菊花品种的根长、2个菊花品种的叶片数和10个菊花品种的根数与对照相比都表现显著降低;处理120 d后,有6个品种的株高与对照相比存在显著性差异,相对处理30 d的数据差异有所减小。另有5个品种的叶片数与对照相比存在显著性差异,这种差异则大于处理30 d的数据。使用姜黄素和5-azaC处理菊花插穗,并设置了不同的处理方式,发现部分品种的开花时间出现提前和延迟的现象,有10个品种的开花时间比对照提前约5-14 d。但所有品种总花期时长基本无差异。同时发现处理苗有6个品种出现植株矮化突变,矮化率在10%左右。经过一段时间生长后统计脚芽发育情况,发现处理与对照的脚芽萌发数量基本一致,说明使用这两种处理剂的处理对菊花脚芽的萌发没有明显的影响。(2)利用MSAP和HPLC的方法检测处理材料的DNA甲基化水平。通过检测10个菊花品种处理组材料(经姜黄素和5-azaC处理后开花时间提前的品种)和对照组材料的DNA甲基化水平,发现处理过的菊花材料比对照材料甲基化程度显著降低。为了进一步证明开花时间的提前与DNA甲基化水平的降低有关,以‘紫精灵’处理组(利用姜黄素和5-azaC处理‘紫精灵’菊花插穗)、对照组及‘紫精灵’MET1-RNAi转基因材料为实验材料,统计开花时间发现MET1-RNAi转基因材料最先开花,其次是‘紫精灵’处理组,最后是‘紫精灵’的对照组材料。通过HPLC法检测花期个材料的DNA甲基化水平,结果发现MET1-RNAi转基因材料DNA甲基化水平最低;处理组材料,除5-azaC处理组外,其他三组与对照相比DNA甲基化水平与对照组相比下降且差异显著。以6个菊花品种的组培苗作为实验样品,设置三个处理方式:单独5-azaC处理、单独姜黄素处理和相同浓度的5-azaC和姜黄素的混合处理。HPLC测定结果显示处理30 d时,除‘瀑水流冰’的混合处理组外,其他处理组与对照相比DNA甲基化水平都表现出显著下降的趋势,移栽后90 d检测结果发现,处理组与对照相比DNA甲基化水平的差异减小,但并未恢复到对照同一水平。同时发现,同种品种不同处理方式材料的DNA甲基化水平下降程度不同,其中只有‘南农丽雅’的混合处理组甲基化水平低于各自的姜黄素和5-azaC处理组。有此可见混合使用姜黄素和5-azaC处理菊花其DNA甲基化水平降低效果不一定优于单独使用某一种甲基化抑制剂,姜黄素和5-azaC混合使用可能对菊花DNA甲基化水平的降低不具有叠加效应。(3)以5-azaC处理的‘金背大红’、‘神马’和‘紫精灵’三个菊花品种和对照材料的叶片为实验样本,利用Illumina Hiseq测序平台进行转录组测序。获得原始数据为191.23G,共1,274,873,854条reads,拆卸接头和低质量的数据后读取并获得清洁clean reads 1,110,456,602条。结果发现5-azaC处理的‘金背大红’品种材料与对照有149个差异表达基因,主要涉及甘油磷脂新陈代谢、苯丙素生物合成、植物病原菌互作等过程。在‘神马’品种材料中,处理组与对照相比,有956个差异表达基因,主要涉及苯丙素的生物合成、氨基酸的生物合成等过程。在‘紫精灵’品种中处理组与对照相比共有1,361个差异表达基因,主要涉及植物激素信号转导、内质网蛋白加工等过程。从上述差异基因中筛选出DNA甲基转移酶和花期相关基因,发现DNA甲基转移酶和组蛋白甲基化酶基因表现为下调趋势,花期相关基因和一些重要编码转录因子基因Cm AP2、Cm MADS、Cm MYB、Cm WRKY1、Cm WRKY15、Cm WRKY40、Cm WRK Y54、Cm EMF2、Cm EMF4基因表现出上调趋势。推测这些花期相关基因可能受DNA甲基化调控。利用实时荧光定量PCR方法,对4个差异表达基因的表达水平进行验证,结果与转录组测序结果一致。综合上述结果,本研究认为DNA甲基化在菊花开花进程中发挥重要的调控作用,通过外施5-azaC和姜黄素会导致菊花DNA甲基化水平改变并造成多种基因的表达差异,从而影响菊花的开花时间。其中使用5-azaC和姜黄素对菊花插穗的处理方法,方便、快捷做到了省钱又省工,更适合生产应用。