色泽品质是果实品质构成的关键因素,直接决定了果实的商品价值。类胡萝卜素是人类生活中必不可少的营养物质之一,这些类胡萝卜素合成并储存于有色体中,同时有色体也是其他一些重要的次生代谢物和激素(如生育酚和茉莉酸等)的合成和储存器官。因此,研究柑橘果实有色体的结构及其分化机理具有重要的理论意义和应用价值。本研究采用6个柑橘品种,利用细胞生物学、蛋白质组学、分子生物学等手段研究了柑橘果肉有色体的结构、分化及其机理。主要结果如下：1、柑橘果肉有色体的结构、分化及其分子调控机理初探采用光学和电子显微镜比较分析3对红肉和黄肉柑橘品种的有色体结构,并结合高效液相色谱测量的有色体类胡萝卜素的含量与组分数据,结果发现：(1)红肉品种的红肉组织以积累番茄红素或p-胡萝卜素为主,最终形成晶状有色体；而(2)黄肉品种的黄肉组织以积累叶黄素和p-紫黄质为主,最终形成球状有色体。与黄肉野生型材料相比,两对甜橙红肉突变材料[Citrus sinensis (L.) Osbeck]的色泽差异主要来自囊衣和汁胞壁,而其汁胞液所含的有色体类型及其色素组成与野生型保持一致。进而对不同发育时期的红暗柳果实的汁胞壁和汁胞液进行细致的细胞学观察,结合类胡萝卜素测定及Western杂交实验,结果表明柑橘果肉的有色体是由淀粉体分化而来,而非像果皮那样由叶绿体分化而来。最后,对类胡萝卜素代谢相关基因进行实时定量PCR分析,结果表明类胡萝卜素合成和贮存基因显著上调表达,尤其是p-胡萝卜素羟化酶(HYD)的大量表达,而类胡萝卜素降解双氧酶4a (CCD4a)基因明显下调表达,这些均参与p-紫黄质和叶黄素的积累,从而调控球状有色体的分化过程。与球状有色体的分化不同,CCD4b基因在晶状有色体分化过程中转录水平显著上调表达,暗示着该基因可能在晶状有色体的形成过程中起着重要作用。与柑橘果皮有色体分化方式不同,柑橘果肉从淀粉体向有色体的分化模式为我们今后研究有色体分化提供了很好的材料和方向。然而,对于有色体的分化机理的研究还有待进一步挖掘。2、利用蛋白质组学技术研究柑橘果肉有色体分化的可能机理(1)首先,以Nycodenz为梯度分离液,经过三次不连续密度梯度离心,从成熟期的红暗柳果肉中分离出高纯度的有色体。光学和电子显微镜观察结果表明：分离的有色体保持良好的完整性,属于内含大量质体小球的有色体,其直径大小为2-4gm。采用亚细胞器(胞质、线粒体及液泡)的标记抗体,Western杂交实验证明分离的有色体没有以上三种亚细胞器的污染,表明分离的有色体具有很高的纯度。从提纯的有色体中提取总蛋白,经过酶解后进行串联质谱分析,共鉴定到493个有色体候选蛋白,其中418个是高可信度的有色体蛋白(包括89个柑橘特有的新蛋白)。功能分类表明,这418个有色体定位蛋白主要参与以下6大类代谢途径：①碳水化合物代谢；②氨基酸代谢；③蛋白调控与转运；④类胡萝卜素代谢;⑤脂类代谢；⑥氧化逆境相关蛋白。值得注意的是,HDS(羟甲基丁烯基-4-磷酸合成酶),PAP(质体脂相关蛋白)和psHSPs(质体小热激蛋白)是最高丰度蛋白,主要参与类胡萝卜素的合成与储存以及逆境胁迫等代谢途径。与呼吸跃变型的番茄果实的有色体蛋白谱相比,两者的大多数蛋白为与氨基酸代谢、碳水化合物代谢、次生代谢、逆境及蛋白调控与转运相关的蛋白；但是,柑橘有色体有着更完善的类胡萝卜素合成途径,更广泛的氨基酸合成途径以及完整的脂类代谢特别是茉莉酸合成途径。考虑到质体定位的小热激蛋白21 (psHSP21)在柑橘有色体总蛋白中占着极高的比重,推测该蛋白可能在柑橘发育中起着特殊且重要的作用。总之,本文首次建立柑橘果肉有色体的提纯方法,并且从蛋白水平上揭示柑橘有色体代谢活动的保守性和独特性。(2)比较蛋白质组学解析柑橘果实成熟和衰老过程中的有色体分化的蛋白动态变化柑橘果肉的成熟过程伴随着淀粉体向典型有色体的转化过程。该过程主要特点为：淀粉粒逐渐降解而质体小球数量显著增多,同时整个质体的内膜系统有着复杂的重排过程。我们采用基于iTRAQ的比较蛋白质组学技术,研究柑橘有色体分化过程中的蛋白动态变化以解析柑橘果实在绿熟期、破色期、成熟期和过熟期中的质体结构重排过程。经严格的生物信息学分析,一共鉴定到1905个蛋白,其中1386个为质体候选蛋白,其中又有1016个蛋白具有iTRAQ值。采用5个来自不同代谢途径的抗体,Western杂交实验表明iTRAQ值与真实的蛋白丰度变化相符,证明该数据具有很好的可靠性。从淀粉体向有色体转化过程中主要有以下变化：(a)参与质体小球形成、类胡萝卜代谢和蛋白降解的相关蛋白的蛋白丰度显著增加；(b)参与蛋白合成相关蛋白的蛋白丰度显著下调；(c)参与信号、细胞和DNA & RNA相关蛋白的蛋白丰度则保持相对稳定。特别值得注意的是,质体蛋白运输稳定,质体翻译机制与组装活性显著降低及蛋白酶体降解机制普遍上升,这些变化表明了它们可能在有色体内膜重塑过程中起着关键的重要作用。另外,本研究首次评价了有色体衰老过程中质体蛋白的变化,蛋白丰度显著上调的蛋白主要为参与氧化逆境胁迫、细胞、电子传递、转运及TCA/org途径相关的蛋白；蛋白丰度显著下调的蛋白主要为参与蛋白合成、主CHO代谢以及辅助因子和维他命代谢途径相关的蛋白；而质体小球定位蛋白的蛋白丰度则变化不明显。总得来说,本研究从蛋白水平上揭示了淀粉体向有色体(异养型质体之间)分化过程的蛋白动态变化及有色体衰老过程的蛋白变化,为今后研究柑橘果实发育提供了宝贵的线索。3. ABC1K激酶家族的功能初探(1)比较蛋白质组研究发现CitABCK1、3、7和9随着有色体的发育其蛋白丰度显著上升。进一步的亚细胞定位实验表明CitABCK1、3和9定位于质体的质体小球中。我们构建ABCK1、3和9基因的超量和沉默相关载体,并稳定遗传转化到柑橘愈伤、番茄和拟南芥中进行相关功能研究。相关实验正在进行中。(2)柑橘有色体及质体小球磷酸化蛋白质的深度挖掘。由于ABC1K属于定位于质体中的激酶,为了寻找可能的磷酸化修饰底物,我们对柑橘果肉有色体进行磷酸化蛋白质组分析。与其他质体类型一样,有色体具有重要的合成与代谢活性,而这些活性往往受到翻译后修饰,特别是蛋白质磷酸化修饰调控。因此,从未成熟期、破色期和成熟期的红暗柳橙果肉中提纯质体,并提取其中的总蛋白,采用Ti02法富集磷酸化蛋白,结合串联质谱进行蛋白质鉴定,共鉴定到109个质体磷酸化蛋白,包括179个唯一的磷酸化位点和135个唯一的磷酸化肽段。根据Motif-X (激酶模式抽提软件)分析,共得到两类磷酸化位点修饰模式,一类为脯氨酸导向磷酸模式,另一类为酪蛋白激酶Ⅱ模式。通过与磷酸化蛋白数据库(PhosPhAt和P3DB)的比对,发现约22%的磷酸化蛋白属于新鉴定到的磷酸化蛋白。与叶绿体磷酸化蛋白谱相比,近50%的磷酸化蛋白在两者间具有相当高的保守性。然而,在柑橘有色体的磷酸化蛋白组数据中没有鉴定到与光合作用相关的磷酸化蛋白,却鉴定到更多参与逆境/氧化胁迫响应蛋白。同时,在质体小球中鉴定到一个与类胡萝卜素贮存相关的高度磷酸化的原纤维蛋白1(FBN1),将为后面关于ABC1激酶家族的研究提供有用的线索。总之,本研究首次建立了有色体的磷酸化蛋白谱,为人们了解蛋白磷酸化修饰如何调控有色体的分化过程提供了线索。