本研究是国家"973"课题《基于“药性构成三要素”的中药药性实质研究》(课题编号2007CB512605)的一部分,课题着重考察中药药性形成和药性表达的诸种因素,提出“药性是药物作用于机体状态的、与化学成分相关的生物学效应的归纳和概括”工作假说,认为机体状态、化学成分及生物学效应是构成药性的三要素。其中,机体是药物发挥作用的载体,是功效产出的依托,是构成药性的重要要素。不同的机体状态如何用各种生理指标进行表征,以及不同状态如何影响药物生物效应的表达是研究的内容之一药物代谢是机体对药物作用的一个重要形式,当机体状态发生改变时,这种作用可能受到影响。这些因素可归纳为疾病因素和生理因素。附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品,具有回阳救逆、补火助阳、逐风寒湿邪的功效。附子生用有大毒,多炮制加工降毒后入药。本实验选取附子作为有毒中药的代表,附子中含有的乌头碱、新乌头碱及次乌头碱为其有效且有毒成分,而次乌头碱对于前两者在体内相对稳定。为研究有毒中药毒性与机体状态的关系,拟对次乌头碱的不同状态大鼠药代动力学差异及心脏分布差异进行研究,实验分为以下两个部分：一、建立次乌头碱的简便、稳定且回收率高的生物样品前处理方法,确定大鼠取血时间点。比较液液萃取、甲醇沉淀法和固相萃取法,结果表明,采用液液萃取法,用乙醚对样本进行提取,提取回收率达70%以上,操作简便、成本低,便于临床应用和实验研究。为后期体内次乌头碱分析的准确性和灵敏性提供保障。选取21只大鼠灌胃次乌头碱,灌胃给药剂量为2mg·kg-1。分别于给药后15min、25min、60mim、120min、240mim、420min和660min下腔静脉取血,次乌头碱在正常大鼠体内血药浓度先降后升,在4h附近达到最大血药浓度后,逐渐降低。7小时以后血药浓度降低趋于稳定。次乌头碱在正常大鼠心脏中快速分布,随后下降。在2h处又有吸收峰之后逐渐降低,7小时以后血药浓度降低趋于稳定。结果表明,次乌头碱在心脏中快速分布产生药理毒理作用,与临床报道的作用迅速相符。同时其在体内滞留时间较长。通过上述研究,初步得出次乌头碱在大鼠体内的药代动力学变化规律和在靶器官心脏中的分布情况,确定取血时间为5min、15min、30min、60min、120min、180min、210min、240min、300min、360min、480mim、720min。为下一步进行次乌头碱不同状态大鼠药代动力学和心脏含量分布差异研究奠定基础。二、建立大鼠血浆及心脏中次乌头碱的LC/MS/MS分析检测的内标法。考察次乌头碱在虚寒大鼠、虚热大鼠和正常大鼠体内药代动力学过程的差异及心脏分布的差异。以盐酸普罗帕酮为内标物,大鼠含药血浆及含药心脏匀浆液以液液萃取法乙醚提取,样品经电喷雾离子源正离子化后,通过三重四级杆串联质谱仪,采用多反应离子监测(MRM)扫描方式(次乌头碱监测离子对616.6-105.2)测定大鼠血浆及心脏中次乌头碱浓度。优化的色谱条件为Gemini C18柱(150×4.6mm,5μm), Waters C18预柱；甲醇-0.1%甲酸为流动相等度洗脱,0.5mL.min-1流速。3 min内出峰,内源性物质不干扰样品的测定；血浆及心脏样品中次乌头碱在0.1-12.5ng.mL-1范围内线性关系良好；最低定量限为0.1ng·mL-1。高、中、低三种浓度含药血浆样品日内精密度和日间精密度良好,提取回收率稳定,样品室温、冰冻(-80℃)、冻融、残渣冷冻(-20℃)条件下稳定性均符合要求。该测定方法具有灵敏度高、专属性强、快速的优点,符合生物样品分析要求。用氢化可的松复制虚寒模型,地塞米松复制虚热模型,正常大鼠给予生理盐水,2周后,于给药后5min、15min、30mim、60min、120min、180min、210min、240min、300min、360min、480min、720min取血及心脏,处理、测定,绘制药时曲线及心脏分布曲线。可以看出,次乌头碱在正常大鼠体内逐渐吸收,120min处有一吸收峰,之后浓度降低,在240min达到最大血药浓度后,很快降低,300-480min内维持在比较稳定的水平,到720min时含量较低。而在虚寒大鼠体内,120min达到最大血药浓度后,很快降低,300min处有一小吸收峰,随后逐渐降低。在虚热大鼠体内吸收迅速,30min达到最大血药浓度后,很快降低,180-360min之间维持在比较稳定的水平,之后缓慢降低。次乌头碱在虚热大鼠体内达峰速度快于虚寒大鼠和正常大鼠,在虚寒大鼠和虚热大鼠体内的最大血药浓度高于正常大鼠,在三种类型大鼠体内的滞留时间均较长,推测次乌头碱作用属于一种长效机制。双吸收峰现象推测存在肝肠循环。用DAS2.1.1软件处理数据,药物在正常与虚寒、虚热模型大鼠体内过程按非线性统计矩法计算药代动力学参数,正常大鼠AUC0-t分别为834.025ug·L-1·min; MRT0-t为247.144min; t1/2z为145.384min。虚寒大鼠AUCo-t分别为794.75ug.L"l-min；MRTo-t为224.082min; t1/2z为152.502min。虚热大鼠AUCo-t分别为553.625ug·L-1·min; MRT0-t为249.979min；tl／2z为475.683min。次乌头碱在正常大鼠心脏中快速分布,15min即达到最高浓度,随后下降,在120-300min较长时间内维持在稳定水平,之后到720min内含量较低且稳定。在虚寒大鼠心脏中吸收迅速,30min时达到最高浓度,随后含量降低,在60-180min内维持在一个稳定水平,随着时间的推移次乌头碱在体内的含量进一步降低,但是在210-300min内较平稳,360min有一吸收峰,之后逐渐降低并且趋于稳定。在虚热大鼠心脏中逐渐吸收,在120min达到最高浓度后逐渐下降,在210-360min之间有一吸收峰,之后逐渐降低并且趋于稳定。比较三种状态大鼠心脏中次乌头碱的分布可以看出正常组吸收迅速并且含量较高,其次是虚寒组大鼠,虚热组吸收较慢且含量较低。三种状态均有双吸收峰现象,推测存在肝肠循环。由此分布趋势可以看出,次乌头碱在心脏中快速分布产生药理毒理作用,与临床报道的作用迅速相符。同时其在体内滞留时间较长。相同含量的次乌头碱在不同状态大鼠体内吸收分布不同,产生不同的强度的药理毒理作用。通过上述研究,得到次乌头碱在不同状态大鼠体内药代动力学的差异及在心脏中分布的差异。次乌头碱对于虚寒状态是对症治疗,对于虚热状态是反证,对于正常状态作用强烈表现毒性。这与传统中医药理论中的“辨证论治,对症下药”、“毒药之于常人为有毒,对病患则治病”相符合,证明临床强调合理用药的正确性。本研究首次采用虚寒动物模型、虚热动物模型与正常动物相比较检测血药浓度及心脏分布,研究药物与机体状态的相互关系,为研究毒性中药提供新的思路与方法。