SDF-1在血管增殖性视网膜病变中的作用及机制研究

来源 :中山大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:green_wong
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血管增殖性视网膜病变是指由于新生血管的生长伴随着出血、渗出、增殖等病理性改变造成的一组不可逆性致盲性玻璃体视网膜疾病,是世界范围内首要的致盲原因之一。多年来,人们一直致力于寻找诱导并促进新生血管生长的原因,以期取得更有针对性的治疗效果。血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)被认为是最强的促进新生血管生长的因子,围绕其进行的大规模的临床及基础研究——包括VEGF抗体、VEGF受体阻滞剂、小分子RNA干扰等——都取得了很大的突破。然而,不论何种方法都不能完全抑制新生血管的生长,治疗效果并不理想。   基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1 SDF-1)在缺血缺氧组织中,能诱导新生血管的生成,并可能与多条促新生血管途径有协同作用。已有大量研究表明,SDF-1可以趋化骨髓来源的内皮祖细胞参与构成新生血管,并且在视网膜和脉络膜新生血管动物模型中得到证实。然而,SDF-1对成熟的视网膜微血管细胞的作用尚不明确。我们以临床常见的糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)为代表,研究糖尿病视网膜病变患者及糖尿病大鼠眼内SDF-1的表达,进一步探明SDF-1对成熟的人视网膜微血管细胞的作用及其与VEGF可能的关系,为抑制新生血管探索新的突破口。包括3个部分:   第一部分、 SDF-1在糖尿病视网膜病变患者及糖尿病大鼠眼内的表达   目的:研究糖尿病视网膜病变患者及糖尿病大鼠眼内SDF-1的表达及其与VEGF可能的关系,为抑制新生血管探索新的突破口。   方法:   1.随机选择增殖性糖尿病视网膜病变患者30例30眼,以特发性黄斑裂孔患者12例12眼为对照。在玻璃体手术开始时,尚未灌注的条件下,以一个消毒的5ml注射器连接至玻切头,切除0.5-0.8ml未稀释的玻璃体液。ELISA法检测术中获取的玻璃体液中SDF-1和VEGF的浓度,免疫组织化学法评价术中获得的纤维血管膜上SDF-1的表达。   2.成年雄性Wistar大鼠25只,STZ腹腔注射诱导糖尿病,分别提取成模后2周、1个月、3个月大鼠及正常大鼠视网膜总RNA,通过逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)检测SDF-1、VEGF mRNA的表达变化。Gel analyser软件测定各条带IOD值,分别与对应β-actin IOD值相比,进行定量分析。   结果:   1.糖尿病视网膜病变患者玻璃体SDF-1的平均浓度为298.40±24.57 pg/ml,特发性黄斑裂孔组玻璃体SDF-1的平均浓度为86.91±15.89pg/ml,两组之间有显著性差异(P<.0001)。玻璃体VEGF的平均浓度在糖尿病视网膜病变组为2865.87±387.85pg/ml,对照组为142.42±21.03pg/ml,二者有显著性差异(P<.0001)。在30例糖尿病视网膜病变患者中,玻璃体SDF-1和VEGF浓度存在显著性相关([Pearson correlation coefficient],r=0.62,P<.001)。   2.术中获得增殖性糖尿病视网膜病变纤维血管膜标本14个,SDF-1免疫组织化学染色显示在血管内皮细胞的胞浆中均呈现棕褐色颗粒。   3.糖尿病组大鼠成模2周后,SDF-1 mRNA表达量开始增加,1月后渐达高峰,为正常鼠的2.3倍,P<0.01,3月时SDF-1 mRNA下降,且低于正常组水平,P<0.05。CXCR4mRNA表达量在糖尿病2周和1个月大鼠视网膜中分别为对照组的1.6和2.9倍,P<0.05。3个月的糖尿病大鼠CXCR4mRNA表达量有所下降,但与正常大鼠相比无显著性差异。   结论:   1.糖尿病视网膜病变患者玻璃体SDF-1的浓度明显升高,且和VEGF浓度存在正相关;糖尿病视网膜病变纤维血管膜上可见SDF-1阳性的内皮细胞和炎性细胞,提示SDF-1参加了糖尿病视网膜病变新生血管的形成。   2.与正常大鼠相比,糖尿病大鼠视网膜组织高表达SDF-1及其受体CXCR4,提示SDF-1可能参与了糖尿病视网膜病变的发生与发展。   第二部分、缺氧条件下体外培养的人视网膜微血管内皮细胞(HRCECs)SDF-1的表达   目的:在体外培养的HRCECs中,观察SDF-1/CXCR4的表达,并探讨缺氧对SDF-1的影响及其与VEGF的关系。   方法:2%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶消化视网膜,获得HRCECs;种于预先包被纤维连接蛋白的培养瓶内,用含10%胎牛血清、内皮细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒添加物的内皮细胞培养基,置于5%CO2、37℃培养箱内培养。相差显微镜观察细胞形态及生长情况。抗第Ⅷ因子相关抗原抗体鉴定HRCECs。免疫组化法观察HRCECs中SDF-1/CXCR4的表达、分布。在缺氧12h、24h、48h和72h,提取HRCECs的RNA,RT-PCR方法检测SDF-1和VEGF的表达。   结果:   1.原代培养的人视网膜微血管内皮细胞24-48h贴壁,HRCECs呈梭形生长,形态、大小基本一致,2周左右细胞融合成铺路石样改变。融合前第Ⅷ因子相关抗原鉴定阳性。   2.免疫荧光染色显示,SDF-1/CXCR4均胞浆红色着色,SDF-1以绕细胞核为明显,近胞膜处荧光减弱;CXCR4细胞膜表现为更强的红色荧光,可以清晰地勾画细胞的轮廓。   3.VEGFmRNA在HRCECs缺氧24h即有明显升高,SDF-1mRNA也在缺氧的刺激下高表达,但晚于VEGF,在缺氧48h开始增加,在72h仍然维持一个较高的水平。   结论:体外培养的HRCECs可表达SDF-1和CXCR4;缺氧是刺激HRCECs分泌SDF-1的因素之一;缺氧条件下VEGF和SDF-1在HRCECs先后高表达。   第三部分、SDF-1对人视网膜微血管内皮细胞作用的体外研究   目的:研究SDF-1干预下,体外培养的人视网膜微血管内皮细胞增殖和迁移活性,并进一步探讨其与VEGF的相互作用关系。   方法:MTT法检测SDF-1促细胞增殖活性,分VEGF组和SDF-1组,每组三种浓度,分别为5 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml;共同作用组为5ng/ml的VEGF联合100 ng/ml SDF-1。Transwell实验检测SDF-1促细胞迁移活性,在显微镜下观察细胞,记数并照相。RT-PCR观察VEGF和SDF-1相互作用,分别以SDF-1或VEGF干预细胞,48h后提取细胞RNA,RT-PCR法观察SDF-1、VEGF及CXCR4的改变。   结果:MTT法显示HRCECs的增殖活性随VEGF的浓度而增加,P值为0.001。SDF-1组三种浓度作用下,细胞的OD值与阴性对照组相比均无明显改变。而当SDF-1与5ng/ml的VEGF共同作用时,SDF-1表现明显地促增殖效果,P<0.01。这种促HRCECs增殖的作用,可被中和抗体(抗人CXCR4)削弱。HRCECs迁移活性呈SDF-1浓度依赖性,在50ng/ml和100ng/ml时与对照组相比有显著性差异P<0.05。倘若联合5ng/ml的VEGF共同作用,其促迁移活性明显增加,但此放大作用可被预先孵育的抗人CXCR4抗体中和。SDF-1以5ng/ml作用于HRCECs时,即显示了刺激VEGF分泌的作用,P<0.05。HRCECs在VEGF的刺激下,CXCR4mRNA表达明显增加,且呈浓度依赖性递增。SDF-1mRNA在VEGF(5ng/ml)的刺激下显著增加,P<0.05。   结论:SDF-1单独作用不能促进HRCECs增殖,但可以提高VEGF促HRCECs的增殖效果;HRCECs迁移活性的增加呈SDF-1浓度依赖性,VEGF可起协同作用;SDF-1和VEGF在促HRCECs形成新生血管的过程中,可以共同作用,相互促进。
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