血液循环游离DNA和血液学相关指标在原发性胃癌中的临床应用研究

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目的探讨血浆和血清中的游离DNA(cell-free DNA,cf-DNA)含量和cf-DNA完整性(长片段基因含量与短片段基因含量的比值[1])在原发性胃癌诊疗和预后中的应用价值,探讨癌胚抗原(Carcinoma embryonic antigen,CEA)及CEA cf-DNA在原发性胃癌中的应用价值,进一步探讨cf-DNA和血液学相关指标在胃癌远处转移中的应用价值。方法第一部分构建ALU基因(Alu repetitive sequence,ALU)质粒标准品,倍比稀释建立标准曲线,建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法。设计115 bp、247 bp长度的ALU内参基因特异性引物,定量检测81例原发性胃癌患者、18例胃良性肿瘤患者、19例胃癌前病变患者、43例健康对照组、36例胃癌患者术后一天、26例胃癌患者术后2个月后随访的cf-DNA含量(所有样本均为血浆和血清两份),结合患者的临床病理资料,探讨cf-DNA含量及完整性在胃癌诊疗中的价值,比较血浆血清的选择在cf-DNA检测中的优劣。第二部分设计CEA基因的特异性引物,定量检测81例原发性胃癌患者、19例胃癌前病变患者、43例健康对照组、36例胃癌患者术后一天、26例胃癌患者术后2个月后随访血浆中CEA cf-DNA含量,并检测各组血清CEA含量,结合患者临床病理资料,探讨其在原发性胃癌诊疗中的应用价值。第三部分检测81例原发性胃癌患者和43例健康对照者血浆cf-DNA以及临床常规血液学指标,与血浆cf-DNA数据联合分析,探讨二者在胃癌转移以及远处转移中的诊疗价值和相关性。结果第一部分(1)成功构建ALU内参基因质粒标准品,以此建立标准曲线,建立SYBR Green实时荧光定量PCR检测方法。(2)血浆cf-DNA含量和完整性在四组之间的差异有统计学意义(ALU247、ALU115以及完整性P值均<0.001),术前术后的差异也有统计学意义(P值均<0.01),随访前后cf-DNA完整性有统计学差异(P<0.05),在有无转移、分期、分化程度间有统计学差异(P值均<0.01)。血浆和血清cf-DNA含量具有相关性且血浆离散趋势更小,因此血浆相比血清更适合cf-DNA的定量检测。ALU247对胃癌诊断的ROC曲线下面积最高(0.985),其对胃癌诊断敏感度和特异性均高于CEA、CA724、CA199等传统的肿瘤标志物。第二部分(1)胃癌血浆CEA cf-DNA含量高于胃癌前病变组和健康对照组,在三组组间比较差异有统计学意义(H=16.600,P<0.001);胃癌术后CEA cf-DNA基因含量低于术前,差异具有统计学意义(U=2.016,P=0.044)。(2)胃癌患者血浆CEA cf-DNA含量与胃癌患者的性别、年龄、吸烟情况、是否合并高血压、临床分期、分化情况、肿瘤大小无明显相关性,与患者转移情况(分为无转移、仅近端淋巴结转移、远端脏器转移三组)相关;血清CEA含量与胃癌患者是否合并高血压、分化程度、转移情况、肿块大小无明显相关性,与患者性别、年龄、吸烟情况、临床分期相关。(3)从ROC曲线上看,血浆CEA cf-DNA对胃癌的诊断效能显著高于血清CEA,当二者对胃癌联合诊断时,ROC曲线下面积达到0.848,诊断效能优于单一指标。第三部分(1)cf-DNA、中性粒细胞计数(Neutrophil count,NE#)、淋巴细胞百分比(Lymphocyte percentage,LY%)、平均血小板体积(Mean platelet volume,MPV)、D二聚体(D-Dimer,D-D)、纤维蛋白原降解产物(Fibrinogen degradation products,FDP)、白球比(Globulin ratio,A/G)、前白蛋白(Pre albumin,PAB)在胃癌有无转移之间有显著差异(P值均<0.05)。(2)cf-DNA含量和D-D、FDP、A/G三个指标之间有一定的相关性。提示巨核细胞受到刺激大量制造血小板的同时,自身的坏死可能会释放大量的DNA到外周血中,成为血浆中cf-DNA的来源之一。结论1血浆cf-DNA含量及其完整性在原发性胃癌的早期诊断中有较高的临床价值,且高于传统的肿瘤标志物;血液cf-DNA含量及其完整性对胃癌患者的分期、分化、转移情况等肿瘤预后相关指标的评估具有一定的参考价值。2尽管相同患者的血浆cf-DNA、血清cf-DNA含量具有一定的相关性,但是cf-DNA在血清中的离散趋势相比血浆更大,因此血浆比血清更适合cf-DNA的检测。3 CEA cf-DNA在胃癌的早期诊断中有一定的价值,且在胃癌转移的评估中有一定的意义。4血浆cf-DNA含量以及部分临床常规检测指标在胃癌的转移判断和预测中有一定的价值,其中血浆cf-DNA和前白蛋白含量是胃癌发生远处转移的独立危险因素。5外周血cf-DNA的检测具有创伤小、取材方便、易于检测、敏感度高等优点,适合临床大规模开展,有较高的应用前景。
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