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乳腺炎是导致奶牛泌乳减少的常见疾病之一，它伴有乳腺组织损伤，给乳制品业造成重大经济损失的同时，也是危害人类健康。金黄葡萄球菌(S. aureus)是一种感染性革兰氏阳性(G+)细菌，是乳腺炎的主要病原之一。生长停滞特异性蛋白6(Gas6)和蛋白S(ProS)是一类分泌性蛋白质，负责结合并激活TAM受体酪氨酸激酶(Tyro3 and Axl and MerTK, TAM)。但是，TAM在金黄葡萄球菌感染所致奶牛乳腺炎中的作用仍然未被充分了解。本文旨在了解金黄葡萄球菌所致乳腺炎的信号传导途径，阐明负调控Toll样受体(TLRs)介导的组织稳态和反馈机制。研究将有助于理解免疫平衡调节中的新靶点，并以此发展针对金黄葡萄球菌所致奶牛乳腺炎的治疗策略。
1.乳腺炎组织的组织病理学检测以及TAM受体激酶的作用
奶牛乳腺炎是严重危害奶牛业的一种疾病，在世界范围内造成了严重的经济损失。奶牛乳腺炎的主要病因是病原菌感染。病原菌引发促炎因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)的大量产生。奶牛乳腺存在抵抗病原菌入侵的先天性免疫防御机制，以防止不必要的炎性损伤。
我们从中国武汉的屠宰场采集母牛健康和异常乳腺组织，采用组织病理学检查，发现感染乳腺组织存在严重的组织病理学改变。H&E染色可见显著的组织病理学改变：乳腺腺泡和乳腺上皮细胞的结构退化以及组织内炎性细胞浸润、水肿和充血。随后，我们采用qRT-PCR检测了乳腺炎奶牛的乳腺组织和正常奶牛的乳腺组织中促炎因子的表达水平。结果表明，与正常乳腺组织相比，金黄葡萄球菌感染的乳腺组织中促炎因子的表达水平显著升高。同时，我们还观察到患乳腺炎乳腺组织中TAM受体激酶(Tyro3，Axl和MerTK)以及SOCS1和SOCS3的基因表达水平也显著高于与正常乳腺组织。在随后的研究中，我们发现牛乳腺组织中MerTK，Axl，Tyro3以及其与配体Gas6和ProS的表达水平随着促炎性因子的上调而增加。然而，我们对TAM受体激酶在乳腺炎中的作用机制仍未完全理解。我们希望通过对奶牛乳腺炎的反馈机制研究，完善奶牛乳腺炎发病机制的认识，为其治疗提供新的思路。
此外，据报道，金黄色葡萄球菌是牛乳腺炎中最常见的致病菌。为进一步验证我们结果，我们在MerTK和Gas6敲除小鼠中构建了乳腺炎体内模型，并使用MerTK和Gas6敲除小鼠乳腺原代细胞构建了体内感染模型，来探究TAM受体家族在金黄葡萄酒球菌诱发的乳腺炎中的作用。
2.MerTK缓解金黄葡萄球菌引起的炎症反应的分子机制
金黄葡萄球菌诱导的急性炎症的主要特征是宿主防御力下降，促炎因子稳态失衡，组织的炎性损伤。MerTK是否通过在RAW264.7中通过SOCS1/3途径抑制TLR2/6信号通路的激活从而缓解金黄葡萄球菌感染引发的炎性损伤。为了阐明TAM受体激酶和相关蛋白在金黄葡萄球菌诱发的乳腺炎中的作用，我们选择RAW264.7构建细胞模型。我们之所以选择巨噬细胞，是因为迄今为止，人们一直认为TAM受体在巨噬细胞上表达时，可以调控巨噬细胞的吞噬和胞吐作用。在金黄色葡萄球菌感染RAW264.7细胞之后，病原体相关分子模式经由TLR2/6激活NF-κB和MAPK信号通路，导致促炎因子表达量显著上调。此外，与对照组相比，金黄葡萄球菌感染的DF-1细胞中MerTK的表达量显著上调。MerTK进一步通过调控SOCS1/3的表达来降解Mal从而抑制TLR2/6介导的信号通路的激活。此外，当沉默RAW264.7中的MerTK时，MAPKs(ERK，JNK，p38)和NF-κB(I?Bα，p65)信号通路中关键蛋白的磷酸化水平显著上调，促进促炎因子的产生。综上所述，MerTK通过SOCS1和SOCS3抑制了对TLR2，TLR6介导的炎性信号途径，在金黄色葡萄球菌诱导的炎症途径和细胞因子的自我调节中发挥了重要的作用。
3.MerTK通过Toll样受体介导的信号传导在乳腺中负调控金黄葡萄球菌诱导的炎症反应
在对抗金黄葡萄球菌诱导的炎症反应中，我们构建了MerTK敲除小鼠乳腺炎模型，发现MerTK通过内在的负反馈调节以平衡宿主防御系统的过度反应。金黄葡萄球菌引发TLR2和TLR6信号转导，随后募集TRAF6，并通过泛素化激活下游复杂的信号转导通路，包括MAPK和NF-κB信号通路。我们发现，一旦乳腺组织和细胞感染，金黄葡萄球菌诱导的TLR2/TLR6激活与MerTK激活将同时发生，导致野生型小鼠乳腺组织和上皮细胞中SOCS1和SOCS3抑制因子表达的升高。同时，在金黄葡萄球菌感染MerTK-/-小鼠乳腺癌中，p65、IκBα、p38、JNK和ERK 的磷酸化显着增加，并产生了更多的促炎因子。此外，MerTK-/-明显抑制了金黄葡萄球菌诱导的STAT1磷酸化和随后的SOCS1/SOCS3表达，这在靶向TRAF6抑制TLR2/TLR6介导的免疫反应的负反馈机制中至关重要。综上所述，我们发现并证实了，在金黄葡萄球菌感染的小鼠乳腺组织和小鼠乳腺上皮细胞(MMEC)中，MerTK通过STAT1/SOCS1/SOCS3信号轴来调节机体内在反馈。
4.Gas6通过TLR信号通路负调控金黄葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎炎症反应
本部分探讨了Gas6在金黄葡萄球菌诱发的乳腺炎中的作用。结果表明，TLR受体激活可启动乳腺组织和上皮细胞的先天免疫应答，而金黄葡萄球菌感染可激活TLR2和TLR6，从而驱动多种细胞内MAPKs和NF-κB信号传导途径。此外，金黄葡萄球菌诱导Gas6，然后激活TAM受体激酶途径，这与通过SOCS1和SOCS3诱导抑制TLR2和TLR6介导的炎症途径。Gas6的单缺失可以诱导TRAF6的大量表达和SOCS1和SOCS3的表达下调，从而作用于TAM受体介导的抗炎作用的调节。金黄葡萄球菌诱导的MAPK及NF-?B和p65的磷酸化也受控于Gas6，Gas6下调金黄葡萄球菌感染的乳腺组织和乳腺上皮细胞中促炎因子(IL-1β，IL-6和TNF-α)的产生。以上体内和体外研究揭示了Gas6介导的负反馈机制，该机制通过诱导SOCS1/SOCS3激活TAM受体激酶(MerTK，Axl和Tyro3)来抑制TLR2和TLR6介导的MAPK和NF-?B信号传导。
综上所述，我们得出以下结论：
炎症相关刺激物会诱发TAM受体酪氨酸激酶家族(Tyro3, Axl and MerTK)的激活。MerTK,Axl,Tyro3的激活依赖于其配体Gas6和ProS。上调TAM受体酪氨酸激酶的表达，可以抑制TLR2和TLR6介导的MAPK和NF-?B信号传导，进而抑制促炎因子引起的瀑布反应。SOCS1/SOCS3通过调控MerTK和Gas6来降解TRAF6/Mal，抑制TLR信号通路传导，减弱机体过度的炎症反应。这一负反馈调节在金黄葡萄球菌诱发奶牛乳腺炎中发挥着至关重要的稳态调节作用。
1.乳腺炎组织的组织病理学检测以及TAM受体激酶的作用
奶牛乳腺炎是严重危害奶牛业的一种疾病，在世界范围内造成了严重的经济损失。奶牛乳腺炎的主要病因是病原菌感染。病原菌引发促炎因子(TNF-α，IL-1β，IL-6)的大量产生。奶牛乳腺存在抵抗病原菌入侵的先天性免疫防御机制，以防止不必要的炎性损伤。
我们从中国武汉的屠宰场采集母牛健康和异常乳腺组织，采用组织病理学检查，发现感染乳腺组织存在严重的组织病理学改变。H&E染色可见显著的组织病理学改变：乳腺腺泡和乳腺上皮细胞的结构退化以及组织内炎性细胞浸润、水肿和充血。随后，我们采用qRT-PCR检测了乳腺炎奶牛的乳腺组织和正常奶牛的乳腺组织中促炎因子的表达水平。结果表明，与正常乳腺组织相比，金黄葡萄球菌感染的乳腺组织中促炎因子的表达水平显著升高。同时，我们还观察到患乳腺炎乳腺组织中TAM受体激酶(Tyro3，Axl和MerTK)以及SOCS1和SOCS3的基因表达水平也显著高于与正常乳腺组织。在随后的研究中，我们发现牛乳腺组织中MerTK，Axl，Tyro3以及其与配体Gas6和ProS的表达水平随着促炎性因子的上调而增加。然而，我们对TAM受体激酶在乳腺炎中的作用机制仍未完全理解。我们希望通过对奶牛乳腺炎的反馈机制研究，完善奶牛乳腺炎发病机制的认识，为其治疗提供新的思路。
此外，据报道，金黄色葡萄球菌是牛乳腺炎中最常见的致病菌。为进一步验证我们结果，我们在MerTK和Gas6敲除小鼠中构建了乳腺炎体内模型，并使用MerTK和Gas6敲除小鼠乳腺原代细胞构建了体内感染模型，来探究TAM受体家族在金黄葡萄酒球菌诱发的乳腺炎中的作用。
2.MerTK缓解金黄葡萄球菌引起的炎症反应的分子机制
金黄葡萄球菌诱导的急性炎症的主要特征是宿主防御力下降，促炎因子稳态失衡，组织的炎性损伤。MerTK是否通过在RAW264.7中通过SOCS1/3途径抑制TLR2/6信号通路的激活从而缓解金黄葡萄球菌感染引发的炎性损伤。为了阐明TAM受体激酶和相关蛋白在金黄葡萄球菌诱发的乳腺炎中的作用，我们选择RAW264.7构建细胞模型。我们之所以选择巨噬细胞，是因为迄今为止，人们一直认为TAM受体在巨噬细胞上表达时，可以调控巨噬细胞的吞噬和胞吐作用。在金黄色葡萄球菌感染RAW264.7细胞之后，病原体相关分子模式经由TLR2/6激活NF-κB和MAPK信号通路，导致促炎因子表达量显著上调。此外，与对照组相比，金黄葡萄球菌感染的DF-1细胞中MerTK的表达量显著上调。MerTK进一步通过调控SOCS1/3的表达来降解Mal从而抑制TLR2/6介导的信号通路的激活。此外，当沉默RAW264.7中的MerTK时，MAPKs(ERK，JNK，p38)和NF-κB(I?Bα，p65)信号通路中关键蛋白的磷酸化水平显著上调，促进促炎因子的产生。综上所述，MerTK通过SOCS1和SOCS3抑制了对TLR2，TLR6介导的炎性信号途径，在金黄色葡萄球菌诱导的炎症途径和细胞因子的自我调节中发挥了重要的作用。
3.MerTK通过Toll样受体介导的信号传导在乳腺中负调控金黄葡萄球菌诱导的炎症反应
在对抗金黄葡萄球菌诱导的炎症反应中，我们构建了MerTK敲除小鼠乳腺炎模型，发现MerTK通过内在的负反馈调节以平衡宿主防御系统的过度反应。金黄葡萄球菌引发TLR2和TLR6信号转导，随后募集TRAF6，并通过泛素化激活下游复杂的信号转导通路，包括MAPK和NF-κB信号通路。我们发现，一旦乳腺组织和细胞感染，金黄葡萄球菌诱导的TLR2/TLR6激活与MerTK激活将同时发生，导致野生型小鼠乳腺组织和上皮细胞中SOCS1和SOCS3抑制因子表达的升高。同时，在金黄葡萄球菌感染MerTK-/-小鼠乳腺癌中，p65、IκBα、p38、JNK和ERK 的磷酸化显着增加，并产生了更多的促炎因子。此外，MerTK-/-明显抑制了金黄葡萄球菌诱导的STAT1磷酸化和随后的SOCS1/SOCS3表达，这在靶向TRAF6抑制TLR2/TLR6介导的免疫反应的负反馈机制中至关重要。综上所述，我们发现并证实了，在金黄葡萄球菌感染的小鼠乳腺组织和小鼠乳腺上皮细胞(MMEC)中，MerTK通过STAT1/SOCS1/SOCS3信号轴来调节机体内在反馈。
4.Gas6通过TLR信号通路负调控金黄葡萄球菌诱导的小鼠乳腺炎炎症反应
本部分探讨了Gas6在金黄葡萄球菌诱发的乳腺炎中的作用。结果表明，TLR受体激活可启动乳腺组织和上皮细胞的先天免疫应答，而金黄葡萄球菌感染可激活TLR2和TLR6，从而驱动多种细胞内MAPKs和NF-κB信号传导途径。此外，金黄葡萄球菌诱导Gas6，然后激活TAM受体激酶途径，这与通过SOCS1和SOCS3诱导抑制TLR2和TLR6介导的炎症途径。Gas6的单缺失可以诱导TRAF6的大量表达和SOCS1和SOCS3的表达下调，从而作用于TAM受体介导的抗炎作用的调节。金黄葡萄球菌诱导的MAPK及NF-?B和p65的磷酸化也受控于Gas6，Gas6下调金黄葡萄球菌感染的乳腺组织和乳腺上皮细胞中促炎因子(IL-1β，IL-6和TNF-α)的产生。以上体内和体外研究揭示了Gas6介导的负反馈机制，该机制通过诱导SOCS1/SOCS3激活TAM受体激酶(MerTK，Axl和Tyro3)来抑制TLR2和TLR6介导的MAPK和NF-?B信号传导。
综上所述，我们得出以下结论：
炎症相关刺激物会诱发TAM受体酪氨酸激酶家族(Tyro3, Axl and MerTK)的激活。MerTK,Axl,Tyro3的激活依赖于其配体Gas6和ProS。上调TAM受体酪氨酸激酶的表达，可以抑制TLR2和TLR6介导的MAPK和NF-?B信号传导，进而抑制促炎因子引起的瀑布反应。SOCS1/SOCS3通过调控MerTK和Gas6来降解TRAF6/Mal，抑制TLR信号通路传导，减弱机体过度的炎症反应。这一负反馈调节在金黄葡萄球菌诱发奶牛乳腺炎中发挥着至关重要的稳态调节作用。