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目的探讨Nrf2/GCH1/BH4在电离辐射前后的皮肤细胞及皮肤组织中的表达情况,过表达Nrf2及GCH1后对人皮肤细胞HaCaT和WS1的辐射保护作用及机制的研究,同时在动物实验中证明Nrf2/GCH1/BH4对放射性皮肤损伤进展的影响及机制。方法(一)Nrf2对放射性皮肤损伤进展的影响:1、建立Nrf2敲除小鼠放射性皮肤损伤模型,并采用苏木素染色及扫描电镜观察小鼠皮肤损伤情况,;2、分离Nrf2敲除小鼠原代皮肤细胞,检测电离辐射照射后细胞存活能力、细胞凋亡等指标,进一步说明Nrf2在放射性皮肤发生发展过程中的作用。3、合成包装过表达Nrf2腺病毒,并用western blot方法验证其表达效果;4、MTT、细胞凋亡及细胞衰老等实验检测Nrf2基因过表达后对受照皮肤细胞的存活能力、凋亡率及电离辐射引起的细胞衰老的影响;5、氧自由基(ROS)、内质网及线粒体特异性荧光探针检测电离辐射照射后,Nrf2对皮肤细胞内ROS清除能力及对各重要细胞器的保护作用;6、利用免疫荧光技术探究Nrf2腺病毒对电离辐射照射后引起的DNA断裂的影响。(二)Nrf2对GCH1及四氢生物蝶呤合成的调控机制:1、利用高效液相色谱(HPLC)、紫外可见光吸收光谱技术探索BH4在电离辐射照射前后的变化;2、采用ELISA及western blot技术检测照射前后皮肤细胞及组织内BH4水平;3、利用免疫荧光技术证明Nrf2在电离辐射作用下的变化;4、利用荧光素酶报告基因、染色质免疫共沉淀及western blot方法检测Nrf2对GCH1基因的直接靶向调控作用;(三)GCH1调控四氢生物蝶呤(BH4)合成对放射性皮肤损伤进展的影响:1、采用MTT、细胞凋亡及细胞衰老等指标检测GCH1在受照皮肤细胞的存活能力、细胞凋亡率及细胞衰老方面发挥的重要作用;2、采用氧自由基(ROS)、内质网及线粒体特异性荧光探针检测受照皮肤细胞过表达GCH1后细胞内ROS水平及各重要细胞器结构及膜稳定性;5)采用免疫荧光技术探究GCH1对受照皮肤细胞DNA损伤修复情况2、Nrf2靶向调控GCH1发挥辐射保护作用:1)合成沉默GCH1的siRNA并采用MTT、细胞凋亡等实验方法阐明Nrf2是通过调控四氢生物蝶呤(BH4)合成的关键酶GCH1发挥辐射保护作用;2)采用氧自由基(ROS)、内质网及线粒体特异性荧光探针检测电离辐射照射后,Nrf2调控GCH1对皮肤细胞内ROS清除作用及对各重要细胞器的保护作用。(四)体内实验:1、建立SD大鼠放射性皮肤损伤模型,照射后三天取皮肤组织检测组织内氧自由基及丙二醛水平;2、建立皮肤损伤模型,皮下注射Nrf2、GCH1过表达腺病毒及BH4溶液后,观察辐射照射后皮肤损伤情况,进行评价并绘制曲线图;结果(一)Nrf2对放射性皮肤损伤进展的影响实验结果:1、与同窝野生型小鼠相比较,Nrf2敲除小鼠更容易发生放射性皮肤损伤,且损伤更为严重;2、分离Nrf2敲除小鼠原代皮肤细胞后,实验结果表明:Nrf2敲除小鼠原代皮肤细胞存活能力较低,细胞凋亡率增加。3、Western blot结果显示Nrf2、GCH1过表达腺病毒能够上调Nrf2及GCH1蛋白表达水平;4、MTT、细胞凋亡及细胞衰老等实验结果显示Nrf2基因过表达后能够增加受照皮肤细胞的存活能力、降低细胞凋亡率,并且能够降低电离辐射引起的衰老细胞数目;5、氧自由基(ROS)、内质网及线粒体特异性荧光探针等实验结果显示:电离辐射照射后,Nrf2能够减少皮肤细胞内ROS,同时保护内质网及线粒体的结构完整和膜电位的稳定性;6、过表达Nrf2腺病毒能够减少皮肤细胞内由射线引起的DNA双链断裂的损伤。(二)Nrf2对GCH1及四氢生物蝶呤合成的调控机制:1)采用高效液相色谱、紫外可见吸收光谱及酶联免疫法(ELISA)等实验结果显示:电离辐射照射后BH4发生变化,含量降低,其衍生物含量增多。2)荧光素酶报告基因结果显示Nrf2能够与GCH1promoter结合,染色质免疫共沉淀(ChIP)结果表明Nrf2能够直接靶向调控GCH1表达,同时western blot方法显示过表达Nrf2能够增加GCH1的蛋白表达水平;(三)GCH1调控四氢生物蝶呤合成对放射性皮肤损伤进展的影响:1、GCH1对放射性皮肤损伤的保护作用:1)MTT、细胞凋亡及细胞衰老等实验结果表明:GCH1在受照皮肤细胞的存活能力、细胞凋亡率及细胞衰老方面发挥的重要作用;4)氧自由基(ROS)、内质网及线粒体实验结果表明:受照皮肤细胞过表达GCH1后细胞内ROS水平降低,线粒体及内质网的结构较为完整且膜电位更加稳定;5)过表达GCH1腺病毒能够减少电离辐射照射后皮肤细胞中γh2AX foci的数目2、Nrf2靶向调控GCH1发挥辐射保护作用:1)合成沉默GCH1的si RNA并采用MTT、细胞凋亡等实验结果显示:过表达Nrf2及GCH1均具有增加细胞存活能力,降低细胞凋亡率的作用,然而敲除GCH1后,Nrf2的保护作用被削弱;2)氧自由基(ROS)、内质网及线粒体检测实验结果表明:敲除GCH1后,Nrf2则失去了清除氧自由基及保护线粒体和内质网重要细胞器的功能;(四)体内实验:SD大鼠放射性皮肤损伤实验结果表明:过表达Nrf2、GCH1及皮下注射BH4组的大鼠皮肤损伤明显缓解;HE染色显示:Nrf2、GCH1及BH4组的皮肤组织角质层厚度较小,皮肤附属器数目较多;结论在电离辐射照射后,Nrf2缺失小鼠的皮肤组织及原代皮肤细胞更易发生皮肤损伤。同时,过表达Nrf2的腺病毒能够减少电离辐射引起的氧自由基产生,能够缓解电离辐射引起的皮肤细胞及大鼠皮肤组织的放射性损伤严重程度。更为重要的是,我们发现四氢生物蝶呤(BH4)合成的限速酶GCH1是Nrf2发挥保护作用的重要效应分子。Nrf2能够直接靶向调控GCH1基因的转录,增加皮肤细胞中GCH1的水平。过表达GCH1能够恢复受照皮肤细胞中的BH4含量及NO产物,逆转抑制电离辐射引起的NOS解偶联,从而清除电离辐射引起的ROS,减轻DNA损伤、细胞凋亡及细胞衰老程度。在动物实验中,皮下直接注射BH4或者注射过表达GCH1的腺病毒能够缓解电离辐射引起的皮肤损伤。综上所述,本课题发现了Nrf2/GCH1/BH4调控通路对电离辐射引起的放射性皮肤进展的影响及调控机制,这一发现可能能够为放射性皮肤损伤治疗提供新的途径和方法。