利用酵母双杂交技术筛选与hPYGO2相互作用蛋白

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Pygopus蛋白最早在果蝇中作为Wg(哺乳动物同源蛋白Wnt)信号通路中的特殊组分被发现的,由此引发了对其功能机理的研究。令人吃惊的是,在果蝇Wg信号转导途径中具有专一功能的Pygopus在小鼠中却有着双重功能,在Wnt相关和Wnt独立的通路中均发挥作用。本文介绍了经典的Wnt信号通路和现阶段对Pygopus蛋白功能的研究情况,并进一步分析了Pygopus蛋白两个保守的结构域在转录过程中的作用。以hPYGO2△NHD为诱饵蛋白筛选人乳腺文库后,我们得到70个阳性克隆。阳性克隆测序并将测序结果用BLAST分析,13,5,22,35,阳性克隆的氨基酸序列分别与CDC73(cell division cycle 73)、BCL6(B—cell CLL/lymphoma 6)、CDC34(cell division cycle 34homolog)、EEF1G(eukaryotic translation elongation factor 1 gamma)四种蛋白具有高度的同源性。在进一步的实验中,我们成功地构建了哺乳动物表达载体p3×Flag—CMV—hpygopusΔNHD,pcDNA3.1—Myc—cdc73和pCMV5—Myc—bcl6三个融合蛋白在293T细胞中均有效表达。其中,通过Co—IP和荧光素报告酶检测实验证明pcDNA3.1—Myc—cdc73与p3×Flag—CMV—hpygopusΔNHD之间存在相互作用,其他蛋白还需要继续验证。 本研究认为,筛选出的4个蛋白在酵母中和hPYGO2△NHD之间存在相互作用。其中,CDC73在人类中为Parafibromin,它是PAF蛋白复合物中的一个成员,参与核内Wg/Wnt信号转导过程;BCL6是一个转录抑制子。推测BCL6蛋白能抑制p53肿瘤抑制因子基因的表达;CDC34是泛素连接酶家族的一员,这个蛋白是一个大的蛋白复合体的一部分,在泛素化介导的细胞周期G1调控子的降解和DNA复制起始的过程中需要它的参与。EEF1G是真核生物转录延伸因子,因为PYGO2有转录激活活性,猜测其可能与转录延伸有关。这些发现对进一步了解hPYGO2△NHD的功能,最终阐明Wnt信号通路的机制都有重要意义。
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