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研究背景阴囊的生理性低温是哺乳动物睾丸正常精子发生和生殖所必需的。如果用手术的方法造成实验动物隐睾或者将睾丸暴露在热环境中,就会引起精子发生的紊乱,具体表现为血管的舒缩障碍、睾丸血流的减少,睾丸重量、精子活率和精子活力的下降,导致不育。冷诱导RNA结合蛋白(Cold Inducible RNA-binding Protein, CIRP)属于冷休克蛋白家族中的一员,持续表达于哺乳动物的睾丸组织中,当睾丸处于阴囊生理性低温时,其表达水平最高,当阴囊温度升高或睾丸处于腹腔中时,其表达水平明显下调,而当温度降到适度低温(32℃)时,其表达水平则明显上调,这种现象与睾丸生精细胞对热应激的反应一致,由此引导我们去研究CIRP基因在精子发生中的作用。研究目的研究CIRP基因在小鼠隐睾中的表达,探讨其与隐睾生精细胞损害的关系。构建小鼠pVAX1-CIRP真核表达质粒,用睾丸曲细精管基因注射并电穿孔的方法将pVAX1-CIRP重组质粒导入小鼠隐睾中,观察睾丸组织中CIRP基因的表达情况。在此基础上进一步探讨CIRP基因高表达是否对隐睾生精细胞具有保护作用及其可能机制。研究方法第一部分：7周龄雄性BALB／c小鼠20只用手术的方法建立左侧隐睾模型,分别于隐睾模型建立后第7天和第10天处死小鼠,取双侧睾丸称重,光镜下观察睾丸组织学变化,RT-PCR检测睾丸CIRP基因mRNA的表达水平,Western-blot险测睾丸CIRP基因蛋白的表达水平,并用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测睾丸细胞凋亡率。第二部分：pBluescript SK(-)-CIRP质粒经EcoRⅠ和PstⅠ双酶切后获得CIRP基因片段,将此基因片段连接到pVAXl载体对应的酶切位点,构建pVAX1-CIRP真核表达质粒,用限制性酶切和基因测序的方法进行鉴定。7周龄雄性BALB／c小鼠32只随机分为两组：实验组用睾丸曲细精管基因注射并电穿孔的方法把pVAX1-CIRP真核表达质粒导入到小鼠左侧睾丸中；对照组小鼠左侧睾丸导入空载的pVAX1质粒,然后用手术的方法建立左侧隐睾模型。于模型建立后第7天和第10天取材,RT-PCR检测睾丸CIRP基因mRNA的表达水平,Western-blot检测睾丸CIRP基因蛋白的表达水平。第三部分：7周龄雄性BALB／c小鼠48只随机分为三组：第一组用电穿孔法将pVAX1-CIRP真核表达质粒导入小鼠左侧睾丸中；第二组小鼠左侧睾丸导入空载的pVAX1；第三组小鼠睾丸曲细精管注射PBS,不做电穿孔,然后用手术的方法建立左侧隐睾模型。于模型建立后第7天和第10天取材,RT-PCR检测睾丸CIRP、p53和Fas基因mRNA表达水平,Western-blot检测睾丸CIRP、p53和Fas基因蛋白表达水平,同时光镜下观察睾丸组织病理学改变,Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测睾丸细胞凋亡率。研究结果第一部分：CIRP基因强表达于小鼠正常睾丸中,手术建立隐睾模型后,隐睾CIRP基因mRNA和蛋白的表达水平较对侧睾丸均明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。术后第10天隐睾CIRP基因mRNA和蛋白表达水平明显低于第7天,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时隐睾的重量较对侧睾丸明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),术后第10天对侧睾丸重量明显重于第7天,差异具有统计学意义(P<0.05),而术后第7天隐睾的重量和第10天比较,差异无统计学意义(P>0.05)。另外隐睾睾丸细胞凋亡率较对侧睾丸明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),术后第10天隐睾睾丸细胞凋亡率明显高于第7天,差异具有统计学意义(P<0.05),而术后第10天对侧睾丸细胞凋亡率和第7天比较,差异无统计学意义(P>0.05)。组织切片显示隐睾侧睾丸生精上皮变薄,生精细胞排列紊乱。第二部分：经酶切及测序鉴定构建的pVAX1-CIRP真核表达质粒正确。运用睾丸曲细精管基因注射并电穿孔的方法将其导入小鼠隐睾后第7天,CIRP基因mRNA和蛋白的表达水平较对照组均明显升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。电穿孔后第10天CIRP基因的表达水平与第7天比较,差异无统计学意义(P>0.05)。第三部分：电穿孔后第7天和第10天,pVAX1-CIRP导入组的隐睾重量均明显重于pVAX1导入组和PBS处理组,差异具有统计学意义(P<0.05)；而pVAXl导入组的隐睾重量和PBS处理组比较,差异无统计学差异(P>0.05)。电穿孔后第7天和第10天,pVAX1-CIRP导入组睾丸细胞凋亡率均明显低于pVAXl导入组和PBS处理组,差异具有统计学意义(P<0.05)；而pVAX1导入组睾丸细胞凋亡率和PBS处理组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。电穿孔后第7天和第10天,pVAX1-CIRP基因导入组睾丸CIRP基因mRNA和蛋白表达水平较pVAXl导入组和PBS处理组均明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)；而电穿孔后第7天pVAX1-CIRP基因导入组p53基因mRNA和蛋白的表达水平较pVAXl导入组和PBS处理组均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)；电穿孔后第10天pVAX1-CIRP基因导入组Fas基因mRNA和蛋白的表达水平较pVAX1导入组和PBS处理组均明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。研究结论1.CIRP基因强表达于小鼠正常睾丸组织中；2.小鼠隐睾CIRP基因的表达水平明显降低,在单侧隐睾模型建立后第7天和第10天的隐睾中CIRP基因的表达水平呈下调趋势；3.CIRP基因表达下调引起睾丸细胞的凋亡增加,从而加重生精细胞的损害,CIRP基因表达下调在隐睾生精细胞损害中可能起着重要的作用；4.运用基因克隆的方法能够成功地构建pVAX1-CIRP真核表达质粒；5.睾丸曲细精管基因注射结合电穿孔技术能把CIRP基因导入到小鼠隐睾中,使其在小鼠隐睾组织中得到正常的转录和翻译,从而上调CIRP基因在隐睾中的表达；6.CIRP基因高表达能一定程度地降低隐睾时腹腔热应激引起的睾丸生精细胞损害；7.CIRP基因高表达能降低隐睾睾丸细胞凋亡率；8.CIRP基因高表达能下调隐睾组织中p53和Fas基因的表达水平。