耐重金属及抗生素胁迫微藻的选育及其生理响应研究

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微藻广泛存在于自然水体环境中,由于其生长速度快、易于大规模养殖、油脂含量高等优点而被广泛研究。然而环境中的重金属和抗生素等物质会对微藻的生长产生抑制或毒害作用,因此选育抗重金属与抗生素胁迫的藻种可以提高藻细胞的适应性。有研究表明微藻细胞在面对非生物胁迫时会通过提高胞内抗氧化酶酶活和增加非酶抗氧化剂含量等来减轻胁迫环境的毒害作用,且植物激素可以提高细胞非生物胁迫的耐受性,达到解除抑制与促进微藻生长的作用。为获得耐受重金属及抗生素胁迫能力的藻株及了解响应这一环境的内在因素,本论文以核糖体工程技术筛选获得一株耐重金属及抗生素藻株,通过探究不同环境条件下藻株生长、产油、胞内抗氧化酶活性、非酶抗氧化剂含量等动态变化,较为全面的阐释耐受这一变化的生理机制,本论文的研究结果可为微藻在逆境环境条件的培养提供一定的理论参考。本文的主要结论如下:(1)本实验通过富集培养与划线分离等手段从采集的水样中获得产油微藻,通过磷酸香草醛法测定其油脂含量发现,藻株H18的油脂含量较高,以H18为出发藻株,通过核糖体工程诱变技术并结合理性筛选模型获得一株耐重金属及抗生素胁迫的藻株Cd13,经显微观察并结合分子生物学鉴定为艾默生脂球藻(Graesiella emersonii)。(2)探究了重金属镉、铬及其复合形式对藻株Cd13生理的影响。结果表明,低浓度重金属能提高微藻的油脂产量;而对于生物量而言,对照组的生物量始终高于处理组,且随Cd2+、Cr6+以及复合重金属浓度的提高,生物量逐渐下降。当藻株Cd13受到重金属胁迫时,其叶绿素合成过程受到抑制,最终导致叶绿素含量逐渐降低,且胞内可溶性蛋白质含量随重金属离子浓度的增加呈现先升高后降低的趋势,微藻细胞还会通过促进抗氧化酶活性和提高非酶抗氧化剂的含量以此平衡因重金属胁迫而造成的胞内ROS含量的剧增,从而维持细胞内环境稳定。在研究上清液中重金属含量的变化时发现,藻株Cd13对重金属镉和铬具有较高的吸附能力。(3)研究了水体中常见的庆大霉素、四环素、卡那霉素、链霉素、新霉素和巴龙霉素等六种抗生素对藻株Cd13生长以及生理的影响。研究结果表明,高浓度抗生素抑制藻株Cd13的生长,而低浓度的抗生素则刺激藻株Cd13产油。各抗生素胁迫处理下藻株的扫描电镜结果表明抗生素胁迫会造成微藻细胞表面发生显著改变,当四环素作用于微藻细胞时,细胞发生明显的质壁分离、干瘪失水以及皱缩现象。当藻株Cd13处在低浓度抗生素胁迫环境下,会促进胞内叶绿素、可溶性蛋白质、脯氨酸和抗坏血酸等含量增加,而且会提高抗氧化酶的活性以抵抗抗生素胁迫导致的胞内活性氧(ROS)的大量生成,大量的ROS会造成严重的细胞膜损伤,甚至造成细胞的死亡。(4)研究了不同种类与浓度植物激素对重金属胁迫环境下藻株Cd13生长及油脂含量的影响,同时初步探究了植物激素解除重金属Cd和Cr胁迫的生理机制。结果表明:藻株Cd13培养至48 h时外源添加12 mg/L 6-苄氨基嘌呤能提高Cd和Cr胁迫环境下藻株的油脂含量,培养结束时油脂含量达到最大值,相较对照组分别提高了25.25%和31.97%。在探究提高油脂含量的内在生理机制时发现,外源植物激素的添加提高了胞内叶绿素、可溶性蛋白质、抗氧化酶活性和非酶抗氧化剂(脯氨酸和谷胱甘肽)的含量,降低了胞内活性氧(ROS)的含量,使细胞免受氧化应激损伤,保护细胞内环境平衡。
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