一.本研究DCs与真菌的相互作用关系，有利于阐明真菌的致病机制以及为抗真菌治疗奠定理论基础。然而，目前关于DCs与真菌相互作用的研究国内外均较少，在国内仅有一份关于DCs与曲霉的研究报道，DCs与P．marneffei相互作用的研究仍是空白，有待于我们加强这方面的研究，以了解宿主的抗P．marneffei感染的免疫机制和P．marneffei逃避机体免疫的机理。同时也为发展有效的免疫治疗和开发新型的抗P．marneffei疫苗提供重要基础。 二、本研究目的以人髓系DCs为靶细胞，研究P．marneffei酵母对人DCs膜表面MHC-Ⅱ类分子、表面协同刺激分子、趋化因子受体的表达情况的影响以及观察经P．marneffei酵母冲击的DCs产生细胞因子IL-12和刺激T淋巴细胞增殖的情况，探讨DCs在P.marneffei感染中的作用机制，为阐明P．marneffei感染的发病机制并指导临床治疗提供科学依据。 三、实验对象和方法1.酵母细胞的制备PMSUMS0152(经形态学及DNA测序鉴定证实)，由本真菌室从1名2岁的血液病患儿血液中分离。 2.人外周血单核细胞来源的DCs的体外诱导培养无菌采取健康人外周静脉血，肝素抗凝。 3.DCs的表型分析收集各组的DCs，用PBS液洗涤细胞两次，分别加入异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)或藻红蛋白荧光(phycoerythrin，PE)标记的单克隆抗体CDIa、CD86、CD83、CD40、HLA-DR。避光4℃标记30分钟，PBS液洗涤2次后用流式细胞仪检测。 4.IL-12p70的检测收集各实验组细胞培养上清液-80℃保存。用酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法检测各组DCs培养上清液中自介素(interleukin，IL)-1 2p70的含量，操作严格按试剂盒说明书进行。试剂盒最低检测量为7.5pg／mL。 5.混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reacion，MLR)另取健康人外周血，按前述方法分离外周血单个核细胞，收集非贴壁细胞为淋巴细胞。用尼龙毛法分离同种异体效应T淋巴细胞。 一 6.Real-time PCR法对趋化因子受体CCR7、CXCR4的mRNA水平的检测采用Trizol法提取细胞总RNA，RNA电泳和紫外分光光度计评估其完整性并估算其产量。以lμg的总RNA为模板合成cDNA。 7.统计学处理正态分布计量资料以平均数±标准差(x±s)表示，三组间均数比较采用方差分析，非正态分布计量资料及方差不齐时采用非参数Kruskal-Wallis检验。采用SSPS 11.5统计软件处理数据，显著性水准设为0.05。实验重复3～6次，每次实验细胞来自不同的供者。 四、实验结果1.人外周血单核细胞来源DCs的形态及其对P.marneffei酵母的吞噬从外周血获得的单核细胞经培养7天，细胞由贴壁状态逐渐转为悬浮，细胞体积显著增大，形态不规则，毛刺多而密。流式细胞仪检测细胞膜表面高表达人外周血非成熟DCs的相对特异性标志CDla。DCs和P．marneffei酵母共培养2h即可以看见显著的吞噬现象，6h后可见DCs内含有大量P.marneffei酵母。 2.DCs受P．marneffei酵母冲击后膜表面分子的变化对DCs的表型检测发现，培养7天后，DCs表面成熟标志CD83，协同刺激分子CD86、CD40和MHC-Ⅱ类分子HLA-DR和比例较低；而DCs与Pmarneffei 酵母共培养24 h后，表型发生了改变，上述表面分子的表达明显增高，显示了DCs的进一步成熟。 3.DCs受P.marneffei酵母冲击后分泌IL-12p70的变化未受P．marneffei酵母冲击的DCs培养上清液中未检测到IL-12p70的产生，而接受P.marneffei酵母冲击的DCs培养上清液中可以检测到IL-12p70的产牛量为28.64±8.4lpg／mL，但较LPS刺激组115.90±19.89pg／mL低，三组间在统计学上有显著性差异(P<0.05)。 4.DCs受P.marneffei酵母冲击后刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力成熟的DCs高表达共刺激分子，有较强的刺激T淋巴细胞活化增殖的能力。 5.DCs受P.marneffei酵母冲击后趋化因子的表达情况经P．marneffei酵母冲击后的。DCs趋化因子受体CCR7的mRNA的表达量较未受冲击的DCs显著增高，其增高程度较LPS刺激组高，三组间在统计学上有显著性差异(P<0.01)。 五、结论1.利用GM-CSF和IL-4可以成功诱导出足量的具有典型细胞形态和细胞表型的非成熟DCs。 2.体外培养的人外周血单核细胞来源的DCs能有效地吞噬加热灭活的P．marneffei酵母细胞。 3.DCs接受P．marneffei酵母冲击后，膜表面MHC—Ⅱ分子和协同刺激分子CD86、CD40、CD83的表达显著上调，能够有效刺激T淋巴细胞的增殖分化。 4.经P．marneffei酵母冲击的DCs能够分泌IL-12p70，但其量小于LPS刺激组，有可能导致宿主对P.marneffei酵母的细胞免疫功能不足。 5.DCs接受P．marneffei酵母冲击后，其趋化因子受体CCR7、CXCR4的表达增强，有利于DCs向次级淋巴组织的T细胞区迁移。