论文部分内容阅读
氮素是植物生长发育必不可少的大量元素之一,也是限制植物生长的主要原因。氮素的吸收与利用效率直接影响植物的生长与发育。研究表明,Dof转录因子家族的一些成员参与调控一系列与氮素的吸收及利用相关的基因的表达,进而提高植物的生长指标。为了筛选出小黑杨中可能促进氮素同化的Dof转录因子成员,我们设计并进行了一系列实验,结果如下:1.利用生物信息学的方法,基于2012年公布的毛果杨V3.0数据库,对毛果杨Dof家族进行重新鉴定,共鉴定出毛果杨中44个Dof家族成员;根据构建的系统进化树的结果将毛果杨Dof家族成员分成4个亚家族,除了PnDof2 外,每个Dof成员都具有完整的Dof保守结构域;除PnDof29蛋白定位在线粒体中外,其他Dof成员都定位在细胞核中;毛果杨Dof成员大多在嫩叶、根中表达。2.为了鉴定出受到氮素诱导的小黑杨Dof转录因子基因,本研究设计了两组独立的氮素处理实验,一组是缺氮3天后,重新进行氮素供应48 h,然后再次断氮48 h,探索缺氮和氮素恢复对小黑杨Dof基因表达的影响。另一种是用三个浓度的铵态氮和硝态氮分别处理小黑杨,探索在不同浓度和不同种类氮素处理下Dof基因表达量的变化。通过这两组实验,筛选出6个响应氮素的Dof基因,PnDof10、PnDof12、PnnDof19、PnDof20、PnDof30、Pn选择 32,个基因进行后续实验:PnDof19、PnDoj20和PnDof30。3.根据已完成基因组测序的毛果杨V3.0数据库设计引物,克隆出小黑杨中上述三个基因的同源基因PnDof19、PnDof20和PnDof30,氨基酸序列分析发现他们都具有Dof结构域和核定位信号;系统进化分析显示PnDof20和PnDof30与已验证具有调控氮素代谢功能的拟南芥AtDof1和海岸松PpDof5聚在一起,说明这两个基因可能参与调控氮素代谢。4.利用基因枪介导的瞬时转化方法,对这3个Dof转录因子进行亚细胞定位,发现它们都定位在细胞核中,这说明PnDof19、PnDof20和PnDof30基因具有核定位信号。5.将PnDof30基因转化至拟南芥中并进行氮素处理,结果表明,在低氮水平下,过表达基因拟南芥具有更好的生长表型;可溶性蛋白和叶绿素含量显著提高,可溶性糖含量显著降低;AMT、NRT 和GS基因家族成员一部分上调表达,一部分下调表达,PEPC和PK基因的表达量显著提高;PEPC、PK、GS、NR的酶活均显著提高。这些结果说明在低氮条件下,过表达PnDof30拟南芥能够提高生长和C/N代谢水平。