人参不定根悬浮培养体系的优化及5L培养体系的建立

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人参是传统名贵中药,目前人参资源几近枯竭,为保护人参资源,满足市场需求。本研究以人参四种不同来源的外植体为材料,通过比较人参不定根形态学的差别,选择出长势良好的最优无性系。并在此基础上,建立摇瓶培养体系,简易生物反应器培养体系,并优化相关培养参数,最后考察了茉莉酸甲酯诱导下人参不定根在生物反应器中皂苷积累和相关关键酶基因表达量,为人参不定根大规模生产人参皂苷提供理论基础和技术基础,主要结果如下:(1)人参不同外植体均能诱导愈伤组织,人参无菌苗叶更容易诱导愈伤组织,人参无菌苗叶柄诱导愈伤组织更难一些。(2)人参四种外植体愈伤组织再分化不定根数目不同,无菌苗叶柄愈伤组织再分化不定根数目最多,不定根长势更好。(3)以人参无菌苗叶柄愈伤组织诱导而来的不定根为原材料,比较B5培养基中12种无机盐元素浓度(1.0倍,0.5倍)组合对人参不定根生长的影响,并利用软件Mintab试验设计筛选出影响最显著的三个因素,分别为:MgSO4·7H2O、NH4NO3和MnSO4·4H2O,利用响应面法优化得到人参不定根最佳培养条件是MgSO4·7H2O:167.29 mg/L,NH4NO3:84.20 mg/L,MnSO4·4H2O:8.28 mg/L,在此条件下,人参不定根鲜重达11.57 g。(4)250 mL悬浮培养条件的优化:通过单因素实验,研究了激素浓度、接种量大小、摇床转速对人参不定根生长的影响,再以Box-Behnken试验设计及响应面优化得到最佳培养参数为IBA浓度4.18 mg/L,接种量0.509 g,摇床转速128.99 rpm,此时人参不定根悬浮培养皂苷产量2.44 mg;(5)500 mL悬浮培养条件的优化:研究4种不同碳源,3种不同浓度处理,结果发现,蔗糖添加浓度30 g/L时,更适合人参不定根的培养。(6)为了优化5 L生物反应器中不定根培养和皂苷积累的培养体系,研究了接种量、装液量、通气量、蔗糖浓度对人参不定根和皂苷积累的影响,结果表明在5 L生物反应器装液量3 L,通气量0.15 vvm,将10 g的人参不定根接种于优化后的B5培养基(IBA 4mg/L+30 g/L蔗糖pH:5.8)此时不定根皂苷生产量最大,为:52.52 mg。(7)比较四年生栽培参与生物反应器培养不定根皂苷含量,发现四年生人参主根皂苷含量为人参不定根中皂苷含量的6.93倍。生物反应器培养不定根中Rd皂苷含量(0.63 mg/g)接近四年生原植物(0.86 mg/g)。(8)茉莉酸甲酯处理,抑制不定根生物量的积累,提高了达玛烷型人参皂苷的含量,其中Rd在48 h变化倍率最大,处理48时,总苷含量最大。(9)茉莉酸甲酯的诱导处理,促进人参皂苷合成途径中PgFPS、PgUGT、PgDDS基因的上调表达。
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