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目的:脓毒症心肌抑制（Sepsis-induced cardiac dysfunction,SICD）是脓毒症导致的部分可逆的心肌收缩力、容量负荷反应性和儿茶酚胺反应性下降,脓毒症心肌抑制患者的病死率显著增加。对于脓毒症心肌抑制的发病机制,目前尚无定论。有研究提示线粒体损伤、活性氧物质（Reactive Oxygen Species,ROS）过度生成在脓毒症心肌抑制中发挥重要作用,因此清除损伤线粒体,维持健康线粒体网络,减少ROS的过度生成对治疗脓毒症心肌抑制具有重要意义。线粒体自噬可特异性的降解损伤线粒体,其过程受到精密的分子信号调控,其中,PINK1/Parkin是最主要的泛素依赖性线粒体自噬调节途径之一。Parkin将线粒体膜蛋白底物泛素化,泛素化的线粒体蛋白被cargo蛋白识别后被自噬双层膜结构包裹,介导了线粒体自噬的过程,因此,特异的蛋白泛素化和泛素化蛋白总量可能是影响线粒体自噬清除水平的关键。泛素特异性蛋白酶30（Ubiquitin-specific Proteases 30,USP30）是位于线粒体外膜的去泛素化酶,细胞实验表明过表达USP30可减少线粒体泛素化蛋白,抑制线粒体自噬,但USP30在心肌损伤中的作用和调节机制目前尚不清楚。因此,本研究以大肠杆菌脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）处理模拟大鼠脓毒症心肌损伤模型,探讨USP30在LPS诱导的心肌损伤中是否存在调节线粒体自噬的作用及可能的作用机制,为精细化治疗提供依据。研究方法:一、线粒体自噬在LPS诱导的心肌损伤中的作用:1、LPS腹腔注射建立LPS诱导的大鼠心肌损伤模型:分别在模型建立后6小时、12小时、24小时、48小时监测大鼠血流动力学指标,随后取心脏标本进行组织病理学检测、线粒体自噬相关蛋白检测（USP30、PINK1、Parkin、泛素化线粒体蛋白、SQSTM1/p62、LC3BII）、免疫荧光成像检测线粒体外膜蛋白TOMM20与自噬膜蛋白LC3B共定位评价线粒体自噬水平。使用线粒体自噬抑制剂环孢素A（Cyclosporin A,Cs A）预处理后,建立LPS大鼠心肌损伤模型,分别在造模后6小时及12小时进行自噬相关蛋白检测。2、体外培养大鼠心肌成纤维H9c2（2-1）细胞系,以培养液中加入LPS建立脓毒症样细胞损伤模型,检测细胞凋亡、细胞内总ROS、三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate,ATP）含量、线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）。二、USP30在LPS诱导的心肌细胞损伤中对线粒体自噬的作用:1、通过慢病毒转染大鼠心肌H9c2（2-1）细胞系,分别过表达和敲减USP30基因,筛选稳定转染细胞株。2、以LPS分别处理上述细胞,检测ROS、ATP总量;免疫印迹法检测USP30、PINK1、Parkin、SQSTM1/p62、LC3BII、线粒体多泛素化蛋白表达,免疫荧光成像检测TOMM20与LC3B共定位水平评价线粒体自噬水平。三、USP30调节LPS诱导的心肌损伤的线粒体自噬的机制:对USP30过表达稳转株的Parkin基因进行过表达,将USP30基因敲减稳转株的Parkin基因进行敲减,并对正常培养的H9c2（2-1）细胞株的Parkin基因分别进行过表达和敲减,以LPS分别处理上述细胞,检测线粒体组分中USP30、SQSTM1/p62、LC3BII、线粒体多泛素蛋白表达,免疫荧光成像检测TOMM20与LC3B共定位水平。结果:1、LPS腹腔注射后6小时大鼠开始出现心肌损伤,12小时后最为显著,表现为左室内压最大变化速率下降和左室舒张末期压力升高,心肌组织HE染色和透射电镜观察见心肌纤维排列松散、线粒体嵴结构紊乱,苍白肿胀,24小时后损伤逐渐恢复。H9c2（2-1）细胞的LPS损伤模型中可见线粒体膜电位下降、ROS生成增加、ATP总合成量减少,未见明显细胞凋亡。线粒体自噬检测提示在LPS腹腔注射后6小时线粒体自噬水平较低,12小时后开始增强,后逐渐下降,随病程呈变化的过程。LPS处理后6小时PINK1/Parkin即明显升高,Parkin由细胞浆向线粒体募集,明显早于线粒体自噬的高峰。在LPS处理后6小时后,线粒体USP30表达水平显著升高,线粒体泛素化蛋白明显减少,12小时后USP30表达逐渐减少,而线粒体多泛素化蛋白表达逐渐增多。2、通过慢病毒转染USP30敲减细胞株的LPS损伤模型中,观察到线粒体多泛素化蛋白增多,线粒体自噬增强,细胞ROS生成减少,ATP合成增加。在USP30基因过表达细胞株的LPS损伤模型中,线粒体多泛素化蛋白减少,线粒体自噬受抑制,细胞ROS生成增加,ATP合成减少。3、将USP30基因敲减不能逆转Parkin基因敲减带来的线粒体自噬抑制,而USP30过表达可部分抵消Parkin过表达所增强的线粒体自噬。结论:在LPS诱导的心肌损伤中,线粒体自噬发挥保护作用;在LPS诱导的心肌细胞损伤中,USP30通过调节Parkin的线粒体泛素化底物水平调控线粒体自噬;降低USP30水平可增加线粒体自噬,促进LPS导致的心肌细胞损伤恢复。